骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)是一类骨分化诱导因子,其在骨骼的发育和再生修复中发挥关键作用,具有广阔的临床应用前景。BMP家族中成骨作用较强的是其中的BMP2和BMP7。目前,临床上所用的重组BMP蛋白是由动物细胞制备,此法产生的BMP蛋白表达量低,制备成本高。本论文利用大肠杆菌表达系统表达重组人骨形成蛋白BMP7-2(rhBMP7-2融合蛋白),透析复性后得到复性蛋白,经体外及体内实验检测证明,复性后的rhBMP7-2具有一定的生物活性。主要研究内容及结果包括:(1)利用重叠PCR技术,通过柔性肽(GlyGlyGlyGlySer)3的基因将BMP7与BMP2成熟肽对应的基因相连接,构建BMP7-2与BMP2-7融合基因,分别克隆至大肠杆菌表达载体 pHis NusA 和 pBV220 中,构建 pBMP7-2、pBMP2-7、pBV220-BMP7-2、pBV220-BMP2-7四种表达质粒,利用大肠杆菌表达系统进行表达,但表达出的rhBMP7-2、rhBMP2-7融合蛋白均以包涵体的形式存在。(2)使用透析复性的方法对两种蛋白进行复性探索,只有部分rhBMP7-2融合蛋白能使用这种方法复性成功,包涵体纯化后,经复性条件优化确定复性体系及步骤为:蛋白用8M尿素变性并将蛋白稀释,使蛋白起始浓度为0.2 mg/mL,然后放入透析袋,透析袋放入尿素浓度为2M的透析液中,透析过夜,然后依次放入尿素浓度为1 M,0M,0M的透析液中,复性时间为每个梯度3h。透析液其他成分为100 mM Na3P04(pH=7.4)、250mMNaCl、10%甘油、4 mM半胱氨酸,0.5 mM胱氨酸,复性温度为4℃,最后通过Bradford法测定得到的复性上清中蛋白浓度为96 μg/mL。(3)利用不同浓度的rhBMP7-2融合蛋白诱导MC3T3-E1细胞(小鼠成骨细胞)和C2C12细胞(小鼠成肌细胞),检测成骨的前期标志物碱性磷酸酶的活性。当rhBMP7-2融合蛋白浓度为0.2 μg/mL,两种细胞的碱性磷酸酶活性最高,并且达到峰值时使用的rhBMP7-2融合蛋白的量均为rhBMP2同源二聚体的1/5;利用茜素红染色法测定蛋白诱导的MC3T3-E1和C2C12细胞细胞基质的矿化情况,细胞基质矿化是成骨的后期指标,结果表明经rhBMP7-2诱导的细胞产生的红色钙盐沉积斑点明显多于rhBMP2同源二聚体;大鼠异位成骨动物模型实验表明rhBMP7-2融合蛋白具有异位成骨能力。