论文部分内容阅读
河豚鱼,学名河纯,泛指的是与我们饮食文化及历史密切相关的一类有毒却又味美的经济鱼类,因其鱼肉质鲜美、营养丰富,一直广受国内外消费者的喜爱。我国自1990年人工养殖成功以来,河豚鱼产业已形成了一定的规模,行业的兴衰直接关系着河豚鱼产业从业人员的利益和我国水产品行业发展的稳定性。近年来,出口方面我国河豚鱼产业面对的是进口国贸易技术壁垒的挑战,内销方面又面临着国内市场繁荣发展的契机,面对此种情况建立起先进完善的河豚鱼成分检测方法迫在眉睫。目前,国内对河豚鱼的检测主要是通过间接检测河豚鱼毒素来完成的,常用的河豚鱼毒素检测方法存在着不同程度的不足,限制了此类方法的广泛应用及发展。PCR技术是通过对物种的特异性基因进行标记将目标生物与其他物种区分开来,能从分子水平上进行物种成分的鉴定,本研究将PCR技术应用到河豚鱼成分检测鉴定的中去,将会对食品中的河豚鱼成分的直接检测开启一条新的思路。本文收集了9种河豚鱼样品,采用5种常用的DNA提取方法,通过测定DNA浓度与纯度、DNA琼脂糖凝胶电泳等方法,对5种DNA提取方法进行比较。选出较优的DNA提取方法,在此基础上对影响DNA提取的3个因素进行优化最终确定适合河豚鱼DNA提取的方法。在前人研究基础上,为提高PCR检测方法的特异性和稳定性,对退火温度、DNA模板量、引物用量这3个因素进行优化实验,最终确定出普通PCR和SYBR-PCR的扩增体系和扩增程序参数,并对两种方法的灵敏度和检出限进行比较,实验结果显示,两者的检测灵敏度和检出限相同。从两种方法的操作效率和对操作者健康的影响程度等方面比较,SYBR-PCR法更符合于现代检验检疫的要求。其反应体系为：SYBR Premix Ex TaqTM (2X) 10 μL,上下游引物(10μM)各0.4μL,DNA模板150 ng,H2O 7.2μL。扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s,66℃延伸34s,循环40次。扩增完毕后,进行熔解曲线分析,程序参数为：95 ℃15s; 60℃1min; 95℃15s。另外,本文对9种河豚鱼的PCR扩增产物进行测序,借助DNAMAN和NEBcutter 2.0在线软件对其测序结果进行了序列比对和酶切位点分析,选取出可以识别9种河豚鱼扩增序列的3种限制性内切酶进行酶切鉴定试验,选出实际酶切结果和理论酶切结果一致的NmeAⅢ酶,随后利用NmeAⅢ酶对以河豚鱼引物进行PCR扩增出现假阳性结果的金枪鱼与鲈鱼样品的PCR产物进行酶切试验,结果表明2种非河豚鱼的酶切图谱和片段大小同河豚鱼有着明显差异,最终确定以NmeAⅢ酶切实验作为河豚鱼成分PCR结果的确证方法。该研究结果不仅对于我国河豚鱼成分检测方法和标准的制定起到一定的技术参考作用,也为今后同类的系统研究奠定了基础。