【摘 要】
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胰蛋白酶是一种动物来源的碱性丝氨酸蛋白水解酶,广泛应用于食品加工、医药及科研等领域。但是胰蛋白酶也具有自切功能,影响其活性和应用。胰蛋白酶专一水解羧基端为精氨酸和赖氨酸的肽键,具有很强的氨基酸位点特异性,并因此在科学研究领域被作为重要的工具酶使用。传统上,胰蛋白酶主要从动物的胰脏中提取,原料受限且分离纯化困难。另外,胰蛋白酶也会攻击自身的赖氨酸和精氨酸位点,导致其酶活力在存储或使用过程中快速下降。
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胰蛋白酶是一种动物来源的碱性丝氨酸蛋白水解酶,广泛应用于食品加工、医药及科研等领域。但是胰蛋白酶也具有自切功能,影响其活性和应用。胰蛋白酶专一水解羧基端为精氨酸和赖氨酸的肽键,具有很强的氨基酸位点特异性,并因此在科学研究领域被作为重要的工具酶使用。传统上,胰蛋白酶主要从动物的胰脏中提取,原料受限且分离纯化困难。另外,胰蛋白酶也会攻击自身的赖氨酸和精氨酸位点,导致其酶活力在存储或使用过程中快速下降。本研究对胰蛋白酶的自切原因进行研究并对其进行抗自切改造,具有重要的研究意义和使用价值。本研究以猪源胰蛋白酶为研究对象,通过基因重组实现胰蛋白酶的微生物异源表达,并通过自切位点进行解析,确定胰蛋白酶的易自溶位点。然后通过同源序列比对和分子模拟技术,对胰蛋白酶可能的自切位点进一步确认,并进行胰蛋白酶的单点和组合突变,验证抗自切效果并筛选获得抗自切效果和比活力性能较好的多点组合突变体,取得了较好的实验结果。具体研究结果如下:本研究使用pPIC9K质粒为表达载体,以P.pastoris GS115为表达宿主,成功实现猪源胰蛋白酶的异源表达,获得比活力16500U/mg(BAEE)左右的野生型胰蛋白酶。通过LC-ESI-Q-TOF MS/MS方法解析自切位点,初步确定胰蛋白酶的易自切氨基酸位点为K133,K157,R115,R107,K97,K77和R57。通过同源序列比对和分子模拟技术确定了适合抗自切分子改造的突变类型,分别为R107H、R107L、R115S、R115T、K133A、K133L、K147D、K157E、K208P和K210A。在此基础上,通过组合突变和性能筛选最终获得了抗自切和比活力性能兼好的多点组合突变体R107L/R115S/K133A、R107L/R115T/K133A、R107L/R115S/K133A/K147D、R10 7L/R 115S/K133A/K147D/K157E 和 R107L/R115S/K133A/K147D/K157E/K208P/K210A,其抗自切效果比野生型胰蛋白酶分别提高了 2.33倍、2.13倍、2.76倍、2.86倍和3.07倍,其初始比活力比野生型胰蛋白酶分别提高了 1.74倍、1.46倍、1.34倍、1.12倍及0.09倍,抗自切效果提高的同时不同程度的提高了酶活性,具有巨大的开发价值。基于LC-MS/MS方法评估底物位点特异性,结果显示其酶解产物的种类及相对丰度与野生型相比无明显改变,说明这些胰蛋白酶突变体的位点特异性无明显变化。本研究获得的抗自切效果较好、比活力较高和特异性无明显改变的新型胰蛋白酶制剂,在P.pastoris细胞中的表达量最高为0.43 mg/mL,可大规模工业生产和显著改善应用效果,这对于促进其在科研、医药和食品等领域的应用具有重要意义。
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