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淀粉是作物种子的主要贮藏物质,它不仅是作物产量的主要构成部分,而且是重要的品质因子。面对当前人口激增、自然资源巨大消耗的严峻形势,使得对淀粉这种天然资源的研究显得尤为迫切和需要。玉米淀粉是各种作物中化学成分最佳的淀粉,目前它不仅是我国食品和饲料的主要来源,而且还广泛应用于医药、化工、纺织、造纸、建筑和塑料工业等多个领域,对于我国的经济发展具有举足轻重的作用。
淀粉的生物合成是在一系列酶的作用下共同催化完成的,在淀粉合成的最后阶段有四个关键性的酶一起合成了淀粉:腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合成酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)及淀粉去分支酶(DBE)。许多研究显示,一些逆境胁迫,如高温、干旱、光照不足以及施加过量氮肥等能抑制淀粉合成相关酶基因的表达,最终导致淀粉含量的降低和作物产量的减少。说明淀粉合成关键基因转录水平的调控是淀粉合成调控的一个重要途径,影响着淀粉的合成和积累。然而,作为一个重要的代谢调节途径,人们对于淀粉合成关键基因表达调控机理的认识还非常有限,特别是涉及到分子调控水平上的顺式作用元件和转录因子的了解还非常少。
淀粉合成酶是淀粉合成过程中的一个关键性的酶。作物中淀粉合成酶I(SSI)的活性占到了胚乳淀粉合成酶总活性的60％以上。本试验以玉米淀粉合成酶I基因(ZmSSI)为研究对象,对其表达调控的分子机理进行了研究,主要结果如下:
1.对ZmSSI基因表达模式进行了分析。以玉米骨干自交系18R为试验材料,提取了授粉前后叶片、叶脉、根和授粉后不同时期籽粒的总RNA,通过Real-Time PCR分析了.ZmSSI基因的时空表达特性。结果表明,ZmSSI基因在叶片、叶脉中都有表达,表达量叶片高于叶脉,授粉前高于授粉后;在根部几乎不表达;籽粒中授粉后前7天表达量较低,授粉后10天开始大量表达,授粉后20天达到最高。同时还研究了不同糖类和植物激素对胚乳ZmSSI基因表达的影响,结果发现ABA能促进胚乳ZmSSI基因的表达,而蔗糖、葡萄糖、GA对ZmSSI基因表达的影响则非常小。
2.根据已知的ZmSSI基因mRNA序列,通过Genomic Walking法克隆了ZmSSI基因启动子序列,该序列全长1637 bp,与ZmSSI mRNA序列有51bp的重叠区,GenBank注册号为EF432659。启动子区域分析发现,该启动子是一个非典型启动子,没有CAAT box、TATA box等常规启动子元件。为了分析启动子功能,建立了玉米胚乳瞬时表达体系,在不同压力、不同轰击距离下,将pBI221质粒轰击转化到授粉后不同时期的玉米胚乳中,培养24小时后通过X-Gluc染色,统计胚乳上的蓝斑数,筛选最佳转化条件。结果发现授粉后7天、9天的玉米胚乳适合基因枪轰击转化,授粉13天后的胚乳里由于有大量淀粉等贮藏物质积累,转化效率很低;对基因枪轰击的压力和距离分析发现900 psi、1100 psi均能有效转化玉米胚乳,650 psi、1300 psi转化效果较差,轰击距离以6 cm为最佳。将克隆的ZmSSI基因启动子(-1586至+51)与gus报告基因连接后,在综合选择的最佳条件下(9 DAP胚乳、900psi、6 cm)转入玉米胚乳,X-Gluc染色后获得了大量蓝色斑点,证明克隆的启动子具有启动活性。同时在最适条件下比较了轰击1枪和轰击2枪的转化效率,结果发现没有明显差异。
3.将克隆的ZmSSI基因启动子(-1586至+51)与Luc报告基因连接后,与内参质粒pUbi-Gus一起用基因枪轰击法转入玉米胚乳,在含有ABA和不含ABA的培养基中培养后通过检测相对LUC活性,验证了ZmSSI启动子受ABA诱导影响。然后分析ZmSSI启动子中的潜在ABA作用位点,设计特异引物对启动子进行一系列片段删除,再分别与Luc报告基因连接后转入玉米胚乳,通过检测在含有ABA和不含ABA的培养基中培养后的相对LUC活性,确定了启动子中ABA的诱导元件位于-369至-301位点之间。分别对启动子-369至-301位点之间的两个潜在的ABA作用元件CACCG。Motif和MotifⅢ进行定点突变后,通过瞬时表达检测两个元件突变对ZmSSI启动子ABA诱导性的影响,结果发现该区域的CACCG motif负责ZmSSI启动子的ABA诱导性。
4.克隆玉米ABI4蛋白的编码序列连接入pET-28(a+)载体,在大肠杆菌RosettaTM(DE3)菌株中进行原核表达后通过Ni-Agarose柱纯化6×His-ABI4融合蛋白,将纯化蛋白在TGE buffer中复性后与含有CACCG motif的ZmSSI启动子区域进行凝胶阻滞实验,证明了ABI4蛋白与启动子-369至-301位点间的CACCG motif特异结合。再将ABI4蛋白的编码序列连入玉米Ubiquitin启动子后面作为作用质粒,与含有CACCG motif的报告质粒一起转入玉米胚乳,检测胚乳中过表达ABI4蛋白对ZmSSI启动子活性的影响,结果发现胚乳中过表达ABI4蛋白能提高ZmSSI启动子活性。Real-Time PCR检测蔗糖、葡萄糖和ABA对胚乳ABI4基因表达的影响发现,胚乳ABI4基因的表达特征与ZmSSI类似,受ABA处理的诱导,而蔗糖、葡萄糖对胚乳ABI4基因的表达影响很小。由此可知,ABI4蛋白介导了ABA对ZmSSI基因的诱导。
5.通过检测一系列ZmSSI启动子片段删除报告载体胚乳瞬时表达后的相对LUC活性发现,删除-65至-11位点严重影响启动子活性。将-65至-11位点区域进行小片段连段突变分析发现,该区域内的3个基序:GTAGAA motif、ACACGCA motif和GCTCGC motif是影响ZmSSI基因表达的关键基序。