目的:VI型分泌系统在革兰氏阴性细菌中广泛存在,被认为是一个重要的毒力决定因子,在细菌生存和致病过程中起重要作用。本课题组前期研究表明伤寒沙门菌中存在VI型分泌系统且证实其具有功能性,本项目将在前期研究的基础上进一步探究VI型分泌系统的表达条件和具有的生物学功能,对于了解VI型分泌系统在伤寒沙门菌生存、环境应激、致病过程等方面的功能有重要意义。方法:1.相关菌株构建(1)sci K::Flag标签菌株:通过自杀质粒同源重组的方法,在伤寒沙门菌sci K(即hcp)基因后加上3×Flag基因序列,使得表达的Sci K蛋白为带Flag标签的蛋白;(2)伤寒沙门菌Δsci G回补株(C-Δsci G):将sci G基因的编码区克隆至p BAD33表达质粒,电转化至VI型分泌系统功能缺陷株Δsci G,制备Δsci G回补株,并通过L-阿拉伯糖诱导基因表达。同时向野生株WT和Δsci G中导入p BAD33空质粒作为对照菌株(分别为WT+p BAD33和Δsci G+p BAD33)。2.VI型分泌系统的表达使用q RT-PCR检测sci K基因的m RNA水平;western blot检测Sci K蛋白表达变化,来分析不同条件对VI型分泌系统表达的影响。各条件因素如下:(1)培养基:将细菌置于不同的培养基(普通LB、模拟巨噬细胞内环境的LPM培养基)中培养;(2)生长时期:将细菌培养至(迟滞期、对数生长早期、中期、晚期和稳态期)不同的生长时期;(3)不同应激条件:细菌培养过程置于不同的应激环境(包括厌氧环境、微需氧环境、有氧环境、酸应激,氧应激,高渗应激,低温、高温)。3.VI型分泌系统生物学功能的初步研究通过比较伤寒沙门菌WT+p BAD33、Δsci G+p BAD33和C-Δsci G,分析VI型分泌系统所具有的生物学功能。包括:(1)生长曲线测定:以OD600为纵坐标,时间为横坐标,绘制WT和Δsci G在普通LB液体培养基中无应激及酸应激,氧应激,高渗应激,低温、高温等应激条件下的生长曲线,分析VI型分泌系统对细菌生长的影响;(2)动力实验:分别取2 ul各菌株菌液注入0.2%LB半固体培养基(Swimming motility),并滴种于0.6%LB半固体培养基表面(Swarming motility),培养12 h,测量各菌株形成的动力圈直径;(3)杀菌活性分析:LPM培养基诱导VI型分泌系统表达后,将WT和Δsci G作为攻击菌按照4:1的比例分别与靶细菌E.coli DH5α/pet28a混合并滴种于LPM固体培养基表面共培养4 h,PBS悬浮菌斑,倍比稀释后滴种于含卡那霉素的LB平板,比较存活靶细菌密度,分析各攻击菌的杀菌活性;(4)生物膜实验:TSB培养各菌株,接种至96孔板。30℃静置培养4天后对生物膜染色,洗脱后570 nm波长下测定吸光度,比较各菌株形成生物膜的能力;提取各菌株总RNA后逆转录为c DNA,利用q RT-PCR检测生物膜相关基因的m RNA水平;(5)上皮细胞黏附实验:将各菌株培养至对数早期(OD600≈0.4),L-阿拉伯糖诱导1 h后与He La细胞按MOI值20:1共培养90 min,裂解细胞后稀释涂板,进行菌落计数,比较各菌株对He La细胞的黏附能力;(6)THP-1细胞内生存实验:培养并诱导各菌株后,以MOI值10:1与巨噬细胞共培养1 h后加入庆大霉素杀死胞外菌。PBS吹洗后每菌株裂解1/3孔的细胞,涂于LB平板计数菌落数T0。另外2/3份细胞分别继续培养12 h和24 h后裂解涂板,计数菌落T12、T24。计算各菌株的T12/T0、T24/T0,以比较各菌株的胞内生存能力。结果:1.成功构建sci K::Flag菌株、Δsci G回补株以及WT和Δsci G空质粒对照株。为进一步研究VI型分泌系统功能奠定了基础;2.Western blot结果表明,有氧环境下LB和LPM液体培养基中各生长时期(包括:迟滞期、对数早期、对数中期、对数晚期、稳态期)均未检测到Sci K::Flag蛋白的表达。各种应激条件下(包括:酸应激、氧应激、高渗应激、高温应激、低温应激),均未检测到Sci K::Flag蛋白的表达。在微需氧环境LPM培养基培养条件下,第8 h检测到细菌Sci K::Flag蛋白开始高水平表达,厌氧环境Sci K::Flag蛋白表达水平显著降低,而有氧环境未检测到Sci K::Flag蛋白的表达;3.生长曲线结果表明,在氧应激条件下,Δsci G的生长速率明显低于WT。在无应激和酸、高渗、高温、低温应激条件下WT和Δsci G的生长曲线无统计学差异;4.动力实验结果表明,Δsci G+p BAD33与WT+p BAD33相比,swimming和swarming均无明显差异;5.杀菌活性分析表明,在体外Δsci G与WT杀菌活性无明显差异;6.生物膜实验表明,Δsci G+p BAD33与WT+p BAD33相比,生物膜形成量明显减少(p<0.05),回补株C-Δsci G生物膜形成量部分恢复;7.q RT-PCR结果显示,Δsci G+p BAD33与WT+p BAD33相比,fim A表达明显下降,bap A、flh D、fli A、flj A、flj B、bcs A、rfa D、wca A、yih P、csg A、csg D表达均无明显差异;8.上皮细胞黏附实验表明,Δsci G+p BAD33与WT+p BAD33相比,上皮细胞黏附能力无明显差异;9.THP-1细胞内生存实验表明,Δsci G+p BAD33与WT+p BAD33相比,巨噬细胞内生存能力明显下降,回补株C-Δsci G巨噬细胞内生存能力有所恢复。结论:在微需氧环境LPM培养基培养条件下,伤寒沙门菌Sci K::Flag蛋白高水平表达。VI型分泌系统对伤寒沙门菌在无应激、酸应激、高渗应激、高温应激、低温应激等条件下的生长无明显影响,但可影响氧应激条件下细菌的生长。VI型分泌系统不影响伤寒沙门菌动力、体外杀菌活性、上皮细胞黏附力。然而可影响伤寒沙门菌在巨噬细胞内的生存能力,并且通过调节菌毛相关基因fim A的表达来影响伤寒沙门菌生物膜的形成。