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背景:RhD阴性孕妇注射抗-D免疫球蛋白（anti-D immune globulin,RhIg）,能够抑制母体产生相应抗体,从而预防或减轻因母婴RhD血型不一致引起的胎儿新生儿溶血病（hemolytic disease of the fetus and newborn,HDFN）。目前RhIg主要通过主动免疫RhD阴性志愿者制备,但是在免疫过程中志愿者可能会发生血管外溶血反应,危害其健康。本课题组前期已经制定了有效的免疫程序,但尚未评价该免疫程序能否保障志愿者的安全,因此,本文进一步对免疫程序的安全性进行分析。其次,相关研究已经报道存在RhD阳性红细胞免疫后的RhD阴性志愿者不产生抗D抗体现象,即“不应答者”现象,但是其不应答机制尚不清楚。本课题组已经提出了Toll样受体3（toll like receptor 3,TLR3）及Ⅰ型干扰素（type Ⅰ interferon,IFN-α/β）可能与RhD同种免疫发生相关,RhD同种免疫发生过程极其复杂,单一的细胞或者通路研究无法对其进行完整解释。目前,蛋白质组学在自身免疫及与炎症有关疾病的研究中得到广泛运用,基于定量蛋白质组学技术筛选出的差异蛋白可能找到免疫调节的新途径。因此我们通过质谱技术定量检测RhD主动免疫后的应答者与不应答者外周血单个核细胞的（peripheral bloodmononuclear cell,PBMC）蛋白表达量并进行生物信息学分析,以找到可能调节RhD同种免疫过程的差异蛋白及其可能参与的信号通路。目的:本研究旨在探讨目前免疫程序的安全性,以在RhD主动免疫中保障志愿者的安全,为我国生产RhIg提供数据支持。其次以RhD阴性志愿者主动免疫后产生的应答者与不应答者PBMC为研究对象,采用质谱技术对RhD主动免疫应答者以及不应答者的PBMC进行检测。定量并筛选出可能与RhD同种免疫过程相关的差异蛋白,分析其可能参与的信号通路,为进一步研究RhD同种免疫机制奠定理论基础。方法:（1）使用RhD 阳性红细胞免疫本研究纳入的23名RhD阴性志愿者,免疫程序由初始免疫及加强免疫组成,初始免疫包括首次初免,二次初免以及三次初免。志愿者初始免疫后经检测出现抗D抗体即可加强免疫。在主动免疫后,抽取志愿者全血检测相关实验室指标（抗D抗体滴度、血细胞分析、肝肾及凝血功能）,进而评价本研究主动免疫剂量的安全性。（2）取志愿者中多次免疫后确定为应答者以及不应答者样本共6例,分为应答组与不应答组,提取PBMC。采用数据非依赖采集（data independent acquision,DIA）质谱技术,筛选出差异蛋白并通过生物信息学方法对其进行分析,如基因本体（gene ontology,GO）注释及 KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集。结合GO分析与文献报道,找到可能与调节RhD同种免疫过程相关的差异蛋白,并分析这些蛋白可能参与的信号通路。结果:（1）在本研究中,23名RhD阴性志愿者初次免疫及加强免疫后其各项生命体征均无异常。首次初免20 mL、30 mL、40 mL、50 mL后,统计分析24小时及1周血常规、肝肾及凝血功能中与溶血性输血不良反应相关的安全性指标,结果显示均无统计学差异（P>0.05）;分析加强免疫0.5 mL、1 mL、2 mL后24小时以及1周的上述指标与每次免疫前最近一次检测值差值,也均无明显差异（P>0.05）;进行1 mL及2 mL加强免疫时,24小时与1周后分别有1名志愿者出现间接胆红素升高临近医学参考值上限及超过医学参考值范围,但均无输血不良反应发生;RhD应答者不同剂量加强免疫后安全性指标变化异常及超出医学参考值的情况无差别（P>0.05）;加强免疫2 mL的抗体效价增高倍数高于0.5 mL,免疫效果更优（P=0.024）;加强免疫1周后,达到满足不同采浆要求的抗D抗体效价时,相应安全性指标差值变化无统计学差异（P>0.05）。（2）本研究共筛选出178个差异蛋白（P<0.05,定量差异倍数绝对值（|Fold change,FCI）>1.50）,其中包括76个上调蛋白,102个下调蛋白。上述差异蛋白主要涉及趋化因子通路及钙离子（Ca2+）信号通路,上调蛋白主要涉及RNA剪接通路,而下调蛋白主要涉及GTP酶活性生物过程。进一步筛选差异蛋白中|FC|>2且可能与调节RhD同种免疫过程有关的蛋白,其中PYHIN1、CTNNBL1、DCAF1、ISG20、LYST在RhD应答者中显著上调,TNFAIP8L2在RhD应答者中显著下调,这些蛋白参与Toll样受体（toll like receptors,TLRs）信号通路,T、B细胞活化相关信号以及趋化因子通路等。结论:（1）本研究制定的免疫程序中未发现影响志愿者安全的现象发生,初步认为能够保障志愿者的安全。在满足安全且有效的前提下,建议优化免疫剂量为首次初免50 mL,加强免疫0.5mL,为我国研发RhIg提供了数据支持。（2）上调蛋白 PYHIN1、CTNNBL1、DCAF1、ISG20、LYST 以及下调蛋白TNFAIP8L2共6个差异蛋白可能参与调节RhD同种免疫应答过程。其中TLRs信号通路在RhD同种免疫中可能受到PYHIN1、LYST蛋白正调节,受到TNFAIP8L2蛋白负调节,趋化因子通路在RhD同种免疫中可能受到ISG20蛋白正调节,T细胞活化信号在RhD同种免疫中可能受到DCAF1蛋白正调节,B细胞活化信号在RhD同种免疫中可能受到CTNNBL1蛋白正调节,为进一步研究RhD同种免疫机制提供科学支撑。