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盐生杜氏藻Dunaliella salina(简称盐藻)是一种抗盐能力很强的单细胞绿藻,具有极强的渗透调节能力。甘油是它的主要渗透调节物质。杜氏藻细胞内有一条专门的调节渗透压的代谢途径,即甘油循环代谢途径,它能对外界盐浓度变化作出迅速反应,调节胞内甘油浓度以使细胞内外达到渗透平衡。3-磷酸甘油(G-3-P)脱氢酶是甘油循环中的第一个酶,在其中起重要的调节作用。因此研究杜氏藻G-3-P脱氢酶的性质具有重要意义。
实验室在前期工作中已获得盐藻Osm-GPD的全长基因,生物信息学分析表明该基因结构相对于其它物种的GPD基因而言非常特殊,即同时具有两个功能结构域:GPD Domain和SGPP Domain。本研究在对具有双功能域的重组盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶的表达条件优化和纯化的基础上,对其性质进行了初步研究。
1、表达条件的优化
通过降低诱导温度和改变诱导剂浓度浓度的方法;在30℃,O.3mmol/LIPTG的条件下,诱导工程菌株BL2l(DE3)/pET32-GPD1.9,目的蛋白质重组盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶以可溶蛋白的形式存在于上清中。
2、重组盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶的纯化
将酶粗提液经Chelating F.F.金属螯合层析,透析,肠激酶酶切,ChelatingH.P.金属螯合层析等步骤,分离纯化了重组3-磷酸甘油脱氢酶,SDS-PAGE结果都显示出一条带,GPD(逆向)比活性为192U/mg,GPP比活性为4440U/mg;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得相对分子质量为60KDa。
3、酶活性影响因素的测定
重组3-磷酸甘油脱氢酶GPD功能域逆向酶活性的最适温度为37℃,最适pH为10.0;GPP功能域酶活性的最适温度50℃,最适pH为7.0;关于盐对该酶的活性影响。低浓度的NaCI(0.05 mol/L)对重组3-磷酸甘油脱氢酶活力略有保护作用。但高浓度NaCl(0.15 mol/L,0.5 mol/L)对酶有一定的抑制作用,并能加快酶的失活,而且浓度越高效应越明显,含0.5mol/L NaCI的酶液保存2 d活力全部丧失。
4、重组3-磷酸甘油脱氢酶动力学研究
通过动力学方法测得重组3-磷酸甘油脱氢酶GPD功能域在25℃,pH为10.0条件下,以3-磷酸甘油和NAD<+>为底物,Km (G3P)为4.21mmol/L Km(NAD<+>)为2.57mmol/L。重组3-磷酸甘油脱氢酶GPP功能域在25℃,pH为7.0条件下,以3-磷酸甘油为底物,Km(G3P)为1.3mmol/L。
动力学结果表明,重组盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶的两个功能域之间没有协同效应。而在产物抑制效果上,甘油对于重组盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶GPD功能域只竞争性抑制3-磷酸甘油,而对于重组盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶GPP功能域是反竞争性抑制。