草莓CHS基因分离、克隆和病毒诱导基因沉默(VIGS)载体构建

来源 :福建农林大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:aman25826882
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查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因是植物体内合成类黄酮物质的重要基因,在植物的生长、发育和抗逆境反应中起着至关重要的作用。本研究分别以拟南芥AtCHS(AT5G13930)及FaCHS(AY997297)序列于NCBI Fragariavesca WGS数据库做blast分析,搜索到2条草莓CHS同源序列分别为FvCHS1-A和FvCHS2-A。此外,在现有的草莓EST数据库(NCBI Fragaria EST,GDR octoploid strawberry ESTs,GDR diploid strawberry ESTs)对这两条基因进行blast分析,结果表明,FvCHS1在草莓果实有表达,并有一些对应的EST序列,而没有与FvCHS2对应的EST序列。为了从八倍体草莓中分离出CHS基因以供VIGS研究,用软件Primer4.0进行如下特异引物设计:FaCHS1-U:5’-TGCAAGACAAGACATGGTGGT-3’,FaCHS1-L:5’-GGAACATCTTTGAGGAGGTGAA-3’;FaCHS2-U:5’-TACGGATTGCCAAGGACATA-3’,FaCHS2-L:5’-CAACAGTCTCCACAGTAAGTC-3’。接着利用RT-PCR分离这两个基因。结果从成熟草莓果实的cDNA克隆出FaCHS1特异的基因片段,长为540bp;从花和花芽的混合cDNA克隆出FaCHS2特异的基因片段,长为639bp。利用生物信息学的方法预测分析了草莓CHS基因的同源性和理化性质。VIGS是研究基因功能的有效途径。它是将目的基因片段导入到病毒载体中,并用该病毒载体去侵染植物,由于植物自身免疫系统的原因,使得目的基因发生沉默。本研究通过反方向插入,将从久香草莓中获得的FaCHS1和FaCHS2基因片段分别嵌入到pTRV2病毒载体中。通过菌落PCR和质粒酶切鉴,已成功构建出含有FaCHS1和FaCHS2基因片段的病毒载体。并将构建好的病毒载体成功的转化到农杆菌GV3101中。总之,本研究将为接下来的通过农杆菌侵染研究草莓CHS基因功能奠定了良好的基础。
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