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有机溶剂中的酶催化反应不仅具有常规酶催化反应所具备的专一性，高效性，反应条件温和等优点，还具有水溶液中酶催化反应无法比拟的优势，如多数反应物在有机溶剂中具有较高的溶解性，酶在有机溶剂中的热稳定性显著提高，可以抑制水所引起的水解反应及副反应，还可以实现许多在水溶液中不可能进行的新反应。但是，酶的催化专一性以及酶催化反应条件苛刻等都限制了其在有机合成中的广泛应用。
为了扩大蛋白水解酶在有机合成中的应用，本论文在我们课题组以往研究的基础上主要开展了以下几方面的研究：首先利用有机溶剂作为反应介质，改变蛋白水解酶对反应底物的立体选择性和底物特异性，以非天然底物代替蛋白氨基酸进行酶催化反应。探索用蛋白水解酶在有机溶剂中催化合成含有D-氨基酸残基的N-保护皮啡肽(1-4)四肽衍生物；并探索用嗜热杆菌蛋白酶粗品在有机介质中催化以N-保护非编码氨基酸作为酰基供体底物的肽键形成反应。系统地研究各种因素对酶催化反应的影响。其次，通过测定自由酶及大孔硅胶固定化酶在不同条件下的活性变化，研究酶的活性与稳定性。此外，除了酶催化多肽合成方法的研究，我们还进一步将本组研发的缩合试剂DEPBT应用于含侧链咪唑基不保护组氨酸二肽衍生物的合成。
1.有机溶剂中蛋白水解酶催化非天然底物形成肽键的研究以非天然底物，D-氨基酸和其它L-非编码氨基酸代替蛋白氨基酸作为蛋白水解酶的反应底物，用α-胰凝乳蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶和嗜热杆菌蛋白酶粗品(Thermoase)在有机溶剂中成功地催化合成了一系列含有非编码氨基酸的寡肽衍生物。并且系统地研究了底物结构，有机溶剂性质及水含量，碱的类型与加入量，反应物的投料比以及反应时间和温度等因素对上述酶催化反应的影响，得到了某些规律性的认识。
首次用α-胰凝乳蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶在有机溶剂中催化合成了含有D-氨基酸残基的B-保护皮啡肽(1-4)四肽衍生物Boc-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-NHNHPh和Boc-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-NH2。在合成N-保护皮啡肽(1-4)四肽衍生物和N-保护皮啡肽(1-2)二肽衍生物Boc-Tyr-D-AlaN2H2Ph的反应中，分别以含有D-氨基酸的非天然底物Boc-Tyr-D-AlaOCH2CF3和D-AlaNHNHPh作为酰基供体和酰基受体底物合成了目标化合物。其次以结构不同的N-保护-L-α-非编码氨基酸(L-鸟氨酸，L-瓜氨酸，L-α-氨基丁酸及苯丙氨酸同系物)作为酰基供体底物，苯丙氨酸衍生物作为酰基受体底物，用嗜热杆菌蛋白酶粗品在甲苯中催化合成了一系列含非编码氨基酸残基的二肽衍生物。由于蛋白水解酶在水溶液中严格选择编码氨基酸作为反应底物，因此上述酶催化反应均不能在缓冲溶液中实现。尤其是在动力学控制的酶催化合成肽反应中，蛋白水解酶对于酰基供体的催化专一性比酰基受体底物更高，因此以非编码氨基酸作为蛋白水解酶的酰基供体底物形成肽键更具挑战性。我们的研究结果表明，有机溶剂可以改变蛋白水解酶的催化专一性(包括立体选择性和底物特异性)，为进一步扩大蛋白水解酶在有机合成中的应用提供了有力的科学依据。
为了进一步定量研究有机溶剂性质对蛋白水解酶立体选择性的影响程度，以α-胰凝乳蛋白酶和嗜热杆菌蛋白酶在有机溶剂中催化以外消旋氨基酸衍生物为底物的酶促反应作为模型反应，用HPLC定量检测了产物中L-与D-构型的比例，以研究蛋白水解酶对外消旋底物的立体选择性。研究结果表明，α-胰凝乳蛋白酶和嗜热杆菌蛋白酶对于酰基供体和酰基受体的立体选择性不同。α-胰凝乳蛋白酶催化外消旋Boc-DL-PheOCH2CF3作为酰基供体底物时，在绝大多数溶剂中对L-氨基酸的立体选择性达到100％；而在以外消旋DL-AlaNHNHPh作为酰基受体底物时，在不同溶剂中检测到10％～33％的D-构型产物生成。说明α-胰凝乳蛋白酶在有机溶剂中对于酰基供体底物的立体构型要求比酰基受体更加严格，而嗜热杆菌蛋白酶在甲苯中对两者的立体构型要求都比较严格。这是由于两种酶的结构及催化反应机制不同所造成的。
通过上述研究，利用介质工程拓宽了蛋白水解酶的底物范围，并系统的研究了有机溶剂性质对酶催化反应的影响。本论文及我们课题组多年来的研究成果表明，酶催化反应的溶剂选择不仅与其疏水参数LogP有关，还与溶剂的其他性质如介电常数等有关。不同酶所适用的进行酶催化反应的有机溶剂不同。如α-胰凝乳蛋白酶通常适于在非极性溶剂(环己烷，二氯甲烷等)中催化反应；而枯草杆菌蛋白酶即可在偶极溶剂DMF中催化反应，又可在极性较弱的乙酸乙酯中催化反应；嗜热杆菌蛋白酶能够在极性差异较大的第三戊醇和甲苯中催化反应。上述规律性为指导进行酶催化反应时的溶剂选择提供了有用的信息。
2.自由酶的稳定性及大孔硅胶固定化酶的活性研究通过测定自由酶及大孔硅胶固定化酶在不同条件下的活性变化，研究了α-胰凝乳蛋白酶在不同介质中的活性及稳定性，以及不同固定化条件对于大孔硅胶固定化酶活性的影响。研究结果表明，α-胰凝乳蛋白酶在有机溶剂乙酸乙酯，甲苯，二氯甲烷和环己烷中搅拌24小时后活性保持在70％以上，而在中性水溶液中仅剩余8％。进一步证明了α-胰凝乳蛋白酶确实能在这几种溶剂中较长时间内维持较高的催化活性。有机溶剂性质、pH值、离子强度及离子类型对α-胰凝乳蛋白酶活性与稳定性均有不同程度的影响。大孔硅胶固定化酶的活性受到酶浓度和吸附酶量等因素的影响。
3.缩合试剂DEPBT用于合成含侧链咪唑基不保护组氨酸的二肽衍生物组氨酸是一个侧链含有咪唑基的碱性氨基酸。组氨酸位于很多酶的活性中心，并且很多生物活性肽中含有组氨酸。它在酶的酸碱催化反应机制中起重要作用。但是在用一般缩合试剂合成含组氨酸的生物活性肽时，组氨酸无论作为酰基供体或酰基受体，其侧链咪唑基在大多数情况下均需要加以保护，否则会引起消旋和一系列副反应。本论文用我们课题组研究开发的DEPBT作为缩合试剂，以不同结构的N-保护氨基酸作为羧基组分，含裸露咪唑环的组氨酸甲酯作为氨基组分，成功地合成了一系列含侧链咪唑基不保护组氨酸的二肽衍生物。与其它缩合试剂比较，省略了保护和脱保护两步反应，简化了实验步骤。为含组氨酸的多肽合成提供了简便的方法，并扩大了DEPBT的应用范围。同时对于研究此课题时所发现的在一定条件下，组氨酸侧链咪唑基不保护时，DEPBT发生的副反应进行了研究。
此外，我们与王振国博士课题组合作研究了具有抗癌活性的桦木酸的结构修饰，及桦木酸衍生物的水溶性和对体外肿瘤细胞的抑制作用。通过在桦木酸及3-羰基桦木酸的28位羧基引入氨基酸，合成了若干桦木酸衍生物。实验结果表明，引入氨基酸明显提高了桦木酸衍生物在水中的溶解度。体外筛选实验表明我们合成的桦木酰-及3-羰基桦木酰-氨基酸衍生物均保持一定的对肿瘤细胞的抑制作用。