PCR技术在对典型有害藻类检测中的应用

来源 :上海海洋大学 | 被引量 : 6次 | 上传用户:poloyzhang
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近二十年来,在我国水域中爆发有害藻华的次数呈上升趋势,其规模逐年扩大,对人类的生产、生活构成极大威胁,构建快速检测方法及预警机制已是迫在眉睫。本文主要研究了甲藻中不同生态类群的演化规律、建立荧光定量PCR和多重PCR方法分别用于对典型有害藻类——利玛原甲藻和微囊藻的检测。所得主要结论如下:1.建立双重TaqMan探针实时荧光PCR方法用于针对利玛原甲藻的快速检测首次建立双重TaqMan探针实时荧光PCR方法用于针对利玛原甲藻的快速检测。实验中,先对纯系培养的利玛原甲藻的rDNAITS和聚酮合酶(PKS)基因进行扩增。测序后,再根据所获取的基因序列分别设计特异性引物和探针,初步建立双重TaqMan探针快速检测方法。结果显示,该方法检测精度较高、重复性较好,基本满足实际检测的需求。这为今后建立对有害藻类的预警机制提供有力支持。2.综合利用PCR技术对微囊藻的检测针对有害藻类——微囊藻,建立多重PCR和荧光定量PCR检测方法。选择微囊藻毒素合成基因mcy、藻蓝蛋白基因PC及ropC1作为目标检测片段,并通过对PCR最佳反应条件的探寻、稳定性测试、灵敏度测试及背景水样干扰实验测试,建立一整套成熟的多重PCR和荧光定量PCR检测方法。结果显示,常规多重PCR方法最低可检测到1.146g/L的微囊藻基因组DNA,全细胞多重PCR方法检测范围在藻液浓度为10~1×10~6个/mL;在实时荧光定量PCR检测中,针对PC、ropC1和mcyDJ序列,最低都可以检测到1个藻细胞。综合利用上述建立的两种检测方法,对采集自上海周边的三大湖泊的水样进行检测。对结果分析后发现,三大湖泊中所检测出的微囊藻mcy基因主要集中在太湖流域和滴水湖,而在淀山湖中未被发现。3.从SSU rDNA和线粒体cox1序列的层面初步分析甲藻中不同生态类群的演化规律。应用SSU rDNA和线粒体cox1序列研究甲藻中不同生态类群的演化关系。通过PCR扩增和测序获取4株甲藻SSU rDNA及其线粒体cox1部分片段,结合GeneBank中24株甲藻的相关序列,以Plasmodium falciparum为外群,构建ML树和NJ树,并采用自展支持度评估进化树分支结构,通过计算后验概率评估进化树整体结构,应用1sKH、SH、ELW和2sKH等方法评估两株ML树间的拓扑结构。结果显示,在由上述两序列构建的进化树上,底栖原甲藻均未与浮游原甲藻聚类,且前沟藻具有独特演化地位。表明联合选择SSU rDNA和线粒体cox1序列构建的进化树在一定程度上能够反映出甲藻的演化规律。这为从基因层面深入探索甲藻中不同生态类群的演化关系奠定了一定基础。
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