二点委夜蛾Athetis lepigone(Moschler)属于昆虫纲(Insecta)、鳞翅目(Lepidoptera)、夜蛾科(Noctuidae)、委夜蛾属(Athetis)。分布于欧洲中东部及北部、日本、俄罗斯、中国、朝鲜等地。二点委夜蛾是中国玉米地的新发害虫,目前已经在山东、河南、河北、江苏、安徽、山西、北京等7省市的玉米种植区爆发成灾。二点委夜蛾的突然爆发严重危害了农业生产,也给植保人员的工作带来了极大的挑战。对该虫的爆发虫源机制尚不清楚,目前主要有两种观点,第一种认为是该虫在适应了当地的环境之后种群扩张而爆发;第二种认为该虫是由于外地虫源的迁入而导致突然的爆发。尽管高空网捕、雷达监测及标放重捕等手段常用来研究害虫的扩散、迁移及暴发的虫源,然而这些方法通常需要投入大量的人力、物力和财力,实验实施的难度系数较大。通过对二点委夜蛾种群遗传结构的研究不仅可以揭示二点委夜蛾地理种群之间的亲缘关系,也可以通过估算种群间基因流的范围和强度,从而解释暴发种群的虫源问题。与传统的高空网捕、雷达监测及标放重捕等手段相比,种群遗传分析具有省时省力和可操作性强的特点。国外还无关于该虫迁移并为害农作物的研究指报道,目前对该虫研究的分子标记仅局限于ISSR和COI基因。针对上述问题,作者利用了 NCBI的二点委夜蛾转录组数据及EST序列,成功扩增出了二点委夜蛾全线粒体基因组从而对线粒体蛋白基因加以筛选,随后开发出了 10对稳定多态的微卫星位点。然后分别将经过筛选的线粒体基因和微卫星位点应用于该虫的种群遗传结构研究,得出的主要结论如下:1)本实验一共测得了 13个单头二点委夜蛾线粒体全基因组序列(GenBank登录号:MF152830-MF152842),全长从15,581bp到15,594bp不等。选取线粒体长度最短的个体作为模式描述二点委夜蛾线粒体基因组的组成与结构。二点委夜蛾全线粒体的结构与其他的鳞翅目昆虫一样,包括了 37个基因,其中23个基因在H链上,14个基因在L链上。在H链上T、C碱基含量高于A、G。在22个tRNA基因中,除了tmS1(GCT)缺少DHU臂外,其余21个都是典型的三叶草结构。与鳞翅目中所有已测定的线粒体基因组一样,二点委夜蛾也发生了trnM重排,形成了trnM-trnI-trnQ(相对于昆虫trnI-trnQ-trnM)的排列方式。二点委夜蛾A+T富集区的长度为540bp,且位置与其他鳞翅目线粒体基因组中一样,位于rrnS和trnM之间。鳞翅目线粒体基因组中A+T富集区具有一定的保守性,而且主要的保守特征在本实验测得的二点委夜蛾线粒体基因组中均可找到。对二点委夜蛾线粒体基因组进行酶切图谱分析,发现酶切位点在整个线粒体基因组上分布并不均匀。整体来看,在COX1上的酶切位点最为丰富,在物种鉴定和种群遗传结构分析中经常作为分子标记手段。2)在测出13个单头二点委夜蛾线粒体基因组后,将所有的蛋白基因截取出来比较多态性与分歧度,以及进行进化选择的检测。结果发现具有较高核苷酸多态性的位点主要位于ND1、ND4、ND5和CYTB基因上,这些基因在种群分化上可能会有更多的信息。ND2,COX2和ATP8三个基因多态性很小,相对很保守。从同义和非同义替换率、ω值、Tajima’ D和Fu and Li’s测试结果来看,二点委夜蛾线粒体蛋白基因大部分都是遵循中性进化的。但是也有一些位点发生了插入式的多样性选择,主要在COX3,ND1,ND3,ND4,ND4L五个基因上。多种模型测试验证了基因上有插入式正选择的位点五个受插入式选择的候选基因中,至少有ND3和ND4L两个基因发生了插入式多态性选择。而且这些基因都是编码线粒体复合体I的,推测受选择的位点与线粒体蛋白功能有重要的联系。3)选用了传统的COI基因和两个多态性最好的基因ND1和CYTB,共三个线粒体蛋白基因相结合作为分子标记对中国8个二点委夜蛾地理种群共222个个体进行种群遗传研究。研究发现8个地理种群的线粒体基因遗传多样性十分丰富,其中较高的种群有漯河(LH)、肥城(FC)、淮阳(HY)、兴平(XP)种群。中性分析表明漯河(LH)、兴平(XP)种群中可能有背景选择的存在,而夏津(XJ)种群有一定的近期种群扩增迹象。从遗传分化指数和AMOVA分析结果来看,石家庄(SJZ)实验室种群与其他7个自然种群之间存在明显的分化,7个自然种群之间的遗传分化并不显著,Mantel检验也表明二点委夜蛾自然种群之间并无地理隔离现象。系统发育分析表明,8个地理种群的单倍型都可以聚在一起,而且大致可以分为两个聚簇,因此这些种群的亲缘关系相互之间都是较近的。而地理距离较远的一些种群仍有共享单倍型,这种现象表明种群间存在较强的基因流。研究结果表明二点委夜蛾极有可能具有一定的长距离迁飞的能力。4)利用二点委夜蛾EST序列开发出二点委夜蛾10个特异性、稳定性及多态性较好的微卫星位点,利用EST序列开发微卫星有效的节约了成本,并且提高了效率。为二点委夜蛾及鳞翅目昆虫后续的种群遗传研究提供了一定的支持。其中由于无效等位基因的存在,AL2和AL9两个微卫星位点明显偏离了哈德温伯格平衡,无法用于后续的种群遗传结构的分析。利用其余8个微卫星位点,对9个(引入河南原阳实验室种群)二点委夜蛾地理种群进行种群遗传结构分析,发现通过不同的方法(FST、STRUCTURE以及DAPC)微卫星都清楚地能将两个实验室种群(河北石家庄和河南原阳)与其他7个自然种群区分开。两个实验室种群明显呈现出较低的遗传分化,表明在实验室条件下大量产生的遗传漂变导致了实验室种群与自然种群间这种明显的分化。不同于实验室种群,7个自然种群则显现出种群遗传结构的缺乏。自然种群中存在着明显的基因流,表明二点委夜蛾极强的传播能力。多个证据显示着中国的二点委夜蛾各种群组成一个大的、随机交配的不分化的种群。此外,我们发现从山东肥城、河南辉县、河南漯河3个种群有着较高的向其他种群迁移的能力。综上所述,我国二点委夜蛾具有一定的遗传多样性,中部内陆区域特别高的遗传多样性以及一定的远距离迁飞能力为其爆发提供了遗传基础。二点委夜蛾线粒体基因的高度多态性以及种群间的分化程度相对较小,较强的基因流使我们应当注意科学合理使用杀虫剂,避免单一的农药施用促进二点委夜蛾抗性基因的产生并广泛传播。