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金属硫蛋白(Metallothionein,MTs)是一类含有丰富的半胱氨酸的金属结合蛋白,能减少自由基对机体的损伤,其在抗衰老,抗氧化,抗肿瘤等过程中发挥着重要影响。本实验室前期成功从河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)中克隆出MT cDNA全长并进行了一系列研究。以此为基础,本研究引入人免疫缺陷病毒反式激活因子(Human immunodeficiency virus transactivator,TAT)穿膜肽,旨在制备一种由TAT介导的能够跨膜转导进入生物体细胞的MT,并进一步研究其穿膜活性及对细胞氧化损伤的修复作用。主要研究内容为:首先利用生物信息学软件分析融合蛋白TAT-MT的理化性质及结构的变化;通过PCR技术在目的基因中加入TAT序列,构建pMD19-T-TAT-MT克隆载体和pEXsec1-TAT-MT、pET28a-SUMO-TAT-MT、pET28a-TAT-MT等原核表达载体;表达TAT-MT重组蛋白并用亲和层析方法进行分离纯化;利用免疫荧光技术检测重组融合蛋白TAT-MT的穿膜活性;测定TAT-MT的体外羟自由基清除率及总抗氧化能力;利用MTT实验确定重组蛋白对细胞氧化损伤的修复作用。研究结果如下:1.河南华溪蟹TAT-MT重组融合蛋白的生物信息学分析使用具有默认参数值的一系列在线软件在线分析预测TAT-MT生物信息学信息,结果显示MT是非跨膜蛋白,而TAT穿膜肽具有穿膜活性,所以融合蛋白TAT-MT是跨膜蛋白;融合蛋白的疏水性区域减少,蛋白稳定性降低;并且反式激活蛋白TAT并不改变融合蛋白中MT的二级结构及生物学活性,与His-MT相比,His-TAT-MT的亲水性和极性提高,等电点提高。2.河南华溪蟹TAT-MT重组融合蛋白原核表达载体的构建DNA测序证实,经长引物PCR技术扩增得到的MT、TAT-MT基因片段不存在核苷酸替换、无突变。然后经过常规的分子实验手段构建原核载体,实验表明,重组质粒pET28a-SUMO-TAT-MT、pEXsec1-TAT-MT、pET28a-TAT-MT原核表达载体构建成功。3.河南华溪蟹TAT-MT重组融合蛋白的优化表达与纯化通过对蛋白最佳诱导条件的筛选,结果显示融合蛋白TAT-MT的最适诱导条件为37℃,1mM IPTG、并且诱导8 h后,获得大量可溶性的TAT-MT,其蛋白的分子大小约为20kDa。经过SDS-PAGE实验检测,结果显示目的蛋白纯化效果良好,大部分杂蛋白被成功的去除,并在最佳诱导条件下大量纯化目的蛋白。4.河南华溪蟹TAT-MT重组融合蛋白穿膜作用及体内外活性研究进行体内细胞穿膜实验,通过免疫荧光实验结果可以看出:MT蛋白不能进入细胞内部,而TAT-MT蛋白与293T细胞共孵育之后,进入细胞膜内或者膜上,结果显示TAT具有体内细胞穿膜功能。利用过氧化氢造成细胞损伤,并通过MTT实验确定了融合蛋白对于细胞损伤的修复作用,体外测定TAT-MT具有良好的羟自由基清除率和总抗氧化能力。以上研究结果证明:TAT介导的金属硫蛋白能顺利进入细胞,对293T细胞的氧化损伤具有修复作用,并具有一定的体外抗氧化能力和羟自由基清除率。研究结论如下:本研究通过长引物PCR,成功克隆了TAT-MT基因,成功构建pET28a-SUMO-TAT-MT、pEXsec1-TAT-MT、pET28a-TAT-MT等多个原核表达载体,成功在大肠杆菌中表达TAT-MT重组融合蛋白。通过细胞免疫荧光实验检测了TAT-MT的穿膜作用,MTT实验表明重组蛋白对细胞氧化损伤具有一定的修复作用,体外抗氧化实验表明TAT-MT具有较高的羟自由基清除能力和总抗氧化能力,该研究为金属硫蛋白的进一步开发应用奠定基础。