第一部分：广西壮族自治区乙肝病毒/黄曲霉毒素双暴露人肝细胞性肝癌的微阵列比较基因组学与比较蛋白质组学的研究目的通过对广西壮族自治区乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)及黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)双暴露水平下肝细胞性肝癌染色体遗传学畸变谱和蛋白质表达谱的分析,寻找与乙型肝炎病毒和黄曲霉毒素相关性肝细胞癌发生发展特定的分子生物学指纹,并初步探讨两因素的协同致癌机制。方法首先对2008年2月到2010年9月来自广西不同地区HCC行根治性手术切除的患者进行筛查,以血清中检测出HBsAg(+)定义为HBV暴露阳性；以P53基因第7外显子249密码子突变阳性伴(或不伴)癌组织中AFB1-DNA加合物免疫组化阳性定义为AFB1长期暴露。根据乙肝病毒与黄曲霉毒素的暴露情况,严格筛选出32例研究对象分为组A：HBV(+)/AFB1(+),共10例；组BHBV(+)/AFB1(-),共10例；组C：HBV(-)/AFB1(+),共6例；组D：HBV(-)/AFB1(-),共6例。另外收集10例来自肝血管瘤、肝外伤、肝移植供体等手术切除的正常肝组织作为正常对照。应用Array CGH技术和iTRAQ结合2DLC-MS/MS技术分析其染色体DNA拷贝数变化以及相关差异蛋白在4个亚组间的表达情况。然后扩大样本量,运用RT-PCR及Western blot技术对Array CGH和蛋白组学部分结果进行验证。结果(1)32例HCC样本中,一共发现有573个染色体畸变区段(Chromosomal aberrations,CNAs)(包括184拷贝扩增区段和389拷贝缺失区段)。其中1q、4p、5p、6p、7p、8q、10p、17q、20p、20q和X主要表现为扩增；1p、2q、4q、8p、9p、10q、11q、13q、14q、16p、16q、17p、19p、19q、21q、22q和Y主要表现为缺失。(2)同时,在32例HCC样本中一共检测出25个染色体DNA拷贝数发生高频重复变化的区段(Recurrently altered regions,RARs).其中,发生高频率扩增(大于30%)的染色体区段有8个,分别是：1q21.1-q44、5p13.2-p15.3、6p12.1-p25.2、7q21.1-q35、8q11.2-q24.3、17q12-q25.2、18q12.3-q22.3和X染色体；发生高频缺失(大于30%)的染色体区段有17个,分别是：1p31.1-p36.2、2q23.2-q37.2、4q12-q35.2、6q14.1-q26、8p12-p23.2、9p21.1-p24.2、10q21.3-q26.2、13q12.1-q21.1、14q21.3-q32.2、16p12.1-p13.2、16q12.1-q24.1、17p12-p133、19p13.1-p13.3、19q13.2-q13.4、21q21.3-q22.2、22q11.2-q13.2和Y染色体。在这25个RARs中,我们发现：2q23.2-q37.2；18q12.3-q22.3；19p13.1-p13.3和Y的遗传学高频改变在别的机构研究中的报道相对较少。8p12-p23.2的缺失在进展期HCC(TNM:Ⅲ-Ⅳ)和低分化HCC(EdmondsonⅢ-Ⅳ)中的发生几率明显高于早期HCC(TNM：Ⅰ-Ⅱ)和高分化HCC(EdmondsonⅠ-Ⅱ)p<0.05)。然而1q21.1-q44的扩增则在早期HCC(TNM：Ⅰ-Ⅱ)中的发生几率显著高于进展期HCC(TNM：Ⅲ-Ⅳ)p<0.05)。(3)4q12-q35.2、13q12.1-q21.1缺失的发生几率以及7q21.1-q35扩增的发生几率在组A中最高,分别为100.0%(10/10)、70.0%(7/10)、70.0%(7/10),但在组D中相对比较低,仅分别为33.3%(2/6)、0(0/6)、16.7%(1/6)。(4)多因素Cox模型分析结果发现： AFP的高低(p=1.019)、肝硬化的有无(p=0.012)、侵袭与转移的发生(p=0.007)、肿瘤TNM分期(p=0.048)以及8p12-p23.2的缺失(p<0.001)和6p12.1-p25.2的缺失(p=0.005)均为影响无瘤生存时间的危险因素。(5)32例HCC样本中,一共还发现22个高水平变化区段(High-level Copy Number Changes, HLCNCs)。其中,14个区段表现为扩增,9个区段表现为缺失。发生在1q21.1-q24.2、1q31.1-q44、8q11.2-q24.3的高水平扩增被发现存在于5例HCC样本中；4q22-q24、13q14.2以及Y染色体(Y11.1-Y11.3)的高水平缺失被发现分别存在于5例、4例及6例HCC样本中。(6)运用iTRAQ结合2DLC-MS/MS技术,一共鉴定出117种差异蛋白,包括53种表达上调蛋白和64种下调蛋白。差异蛋白在四个亚组中分别为组A：共106种；组B：共97种；组C：共104种；组D：共74种。鉴定到的117种差异蛋白主要参与了代谢与解毒、抗凋亡调节、(细胞免疫)抗原提呈与呈递调节过程以及糖酵解等14种生物学过程。并且有47种差异蛋白的编码基因定位于染色体遗传学高频重复变化区域。(7)在鉴定出的117种差异蛋白中,有9种差异蛋白属于热休克蛋白家族蛋白(HSP90AA1, HSP90AB1, GRP78, HSPA1A, GRP75, HSPA8, HSPD1, HSPE1,HSPB1)。他们在组A、组B与组C均表现为上调表达(部分在组D中也呈表达上调)。并且KEGG-PATHWAY功能分类中它们主要参与了抗凋亡途径和(细胞免疫)抗原提呈与呈递调节过程等生物学过程。此外,有15种差异蛋白属于毒物代谢解毒酶相关蛋白(GSTA1, CYP2A13, ADH4, ADH1C, HADH, CYP2E1, CYP27A1, ADH1A, ADH6, EPHX2, EPHX1, AKR1C1, AKR1C4, AKR1B10, AOX1)。除了AKR1B10, AKR1C1, AKR1C4这3种蛋白外,其他12种在组A中均为表达下调蛋白,且半数以上也下调表达在组B与组C中。有趣的是,编码其中11种蛋白的基因定位均分布于染色体高频重复变化的区间内(RARs),它们为CYP2A13, ADH4, ADH1C, HADH, CYP2E1, CYP27A1, ADH1A, ADH6, EPHX2, AKR1B10和AOX。(8)对差异蛋白Aldo-keto reductase family1member B10(AKR1B10)进行RT-PCR和Western blot验证结果显示：AKR1B10基因mRNA在4个亚组中的表达半定量灰度值分别为：组A：1.39±0.69；组B：0.88±0.28；组C：1.03±0.42；组D：0.58±0.14。其中,组A分别与组B、组C及组D相比,其差异均具有统计学意义(p=0.002,p=0.032,p=0.000)。组C与组D相比,其差异也具有统计学意义(p=0.011)；AKR1B10蛋白在4个亚组中的表达水平分别为：组A：2.79±1.30；组B：2.03±0.98；组C：2.23±1.16；组D：1.65±0.49。其中,只有组A与组B及组D相比,其差异均具有统计学意义(p=0.045,p=0.001)。结论1.广西壮族自治区肝细胞癌染色体遗传学改变具有多样性,其中染色体区段19p13.1-p13.3的高频缺失,可能为广西地区肝细胞癌特有的分子生物学特征之一2.染色体区段1q21.1-q44的扩增可能为肝细胞癌发生发展的早期事件；而8p12-p23.2的缺失则可能为肝细胞癌的晚期事件,并且与肝细胞癌的恶性度以及患者的不良预后有关；染色体区段4q12-q35.2、13q12.1-q21.1缺失及7q21.1-q35扩增可能与乙肝病毒/黄曲霉素双因素的协同致癌作用有关。3.乙肝病毒/黄曲霉素双阳性、单乙肝病毒阳性、单黄曲霉素阳性和乙肝病毒/黄曲霉素双阴性4种类型肝细胞癌的蛋白表达谱之间既具有共性,也具有差异性。鉴定出的117差异蛋白分别参与了代谢与解毒、抗凋亡调节、(细胞免疫)抗原提呈与呈递调节以及糖酵解等生物学过程,提示肝细胞癌的发生、发展是一个多基因、多途径参与的复杂过程。4.热休克蛋白家族蛋白的上调表达及毒物代谢解毒酶相关蛋白的下调表达为HBV相关性肝细胞癌与AFB1相关性肝细胞癌常见的分子生物学事件,提示：乙肝病毒/黄曲霉素双因素的协同致癌作用机制,与两者引起热休克蛋白家族蛋白和毒物代谢解毒酶相关蛋白的表达失调有关。5.AKR1B10高表达于乙肝病毒/黄曲霉素双阳性和单黄曲霉素阳性肝细胞癌中,提示：AKR1B10的过表达可能参与了AFB1的致癌过程,并有可能成为潜在的、有诊疗价值的AFB1相关性肝细胞癌分子生物学标志物之一。第二部分：广西乙肝病毒/黄曲霉毒素双暴露肝细胞癌中P53基因、β-catenin基因、PTEN基因突变谱及其表达的初步分析目的通过研究广西壮族自治区人群乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)及黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)双暴露下肝细胞癌中P53基因、β-catenin基因及PTEN基因的突变情况及其表达情况,寻找它们是否具有与乙肝病毒和/或黄曲霉毒素暴露相关特征性分子生物学指纹。并探讨在双暴露情况下上述基因与肝细胞癌发生、发展的关系。方法对2008年4月至2010年6月来自广西不同地区HCC患者手术切除108例肝癌组织、癌旁组织和外周血白细胞,以血清中检测出HBsAg(+)定义为HBV暴露阳性；以癌组织中AFB1-DNA加合物免疫组化阳性定义为AFB1的暴露(以区别第一部分中AFB1的长期暴露定义标准)。根据乙肝病毒与黄曲霉毒素的暴露情况,108例研究对象分为组A：HBV(+)/AFB1-DNA(+),共48例；组B：HBV(+)/AFB1-DNA(-),共27；组C：HBV(-)/AFB1-DNA(+),共19例；组D：HBV(-)/AFB1-DNA(-),共14例。另外收集20例来自肝血管瘤、肝外伤、肝移植供体等手术切除的正常肝组织作为正常对照。运用PCR连同直接测序法检测P53基因、β-catenin基因第3外显子及PTEN基因第4、5、8外显子的突变情况。同时,采用RT-PCR法和(或)免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)法分别检测P53基因、β-catenin基因以及PTEN基因的表达情况。结果(1)P53全长测序显示：108例HCC样本中,一共检测出65例发生突变,突变率为60.2%(65/108)。其中,第7外显子249密码子发生点突变的频率最高,突变率为41.6%(45/108)。此外,还检测出1例在236密码子发生]AC→TGC突变,2例在261密码子发生AGT→AAT突变。P53其余外显子测序结果表明,在5外显子上有1例检测出157密码子发生GTC→CTC突变,1例177密码子发生CCC→CCG突变,6例179密码子分别发生CAT→CGT突变及CAT→CTT突变,4例205密码子发生TAT→TGT突变；在第6外显子上1例检测出214密码子发生CAT→CGT突变,2例219密码子发生ATG→GTG突变。在第8外显子上,1例281密码子发生GAC→GAG突变。1例在306密码子上发生CGA→CGT突变。在第9外显子上,1例320密码子发生AAG→AAA突变。此外,108例配对癌旁组织和20例正常组织中分别检测出1例第7外显子249密码子发生AGG→AGT突变。P53基因突变在组A、组C中的阳性率分别为：87.5%、68.4%,均显著高于组B(33.3%)与组D(7.1%)(p<0.05)。(2)β-catenin基因第3外显子测序显示：在108例HCC组织中,只检测到12例HCC组织在第3外显子的突变,突变率为11.1%。其中1例第32密码子发生GAC→GGC突变,4例37密码子发生TCT→TAT突变,1例37密码子发生TCT→CCT突变,2例37密码子发生TCT→GCT突变；4例41密码子发生ACC→GCC突变。β-catenin基因第3外显子的突变率在组A、组B、组C和组D中分别为14.5%(7/48)、3.7%(1/28)、21.1%(4/19)和0,其差异在4个亚组间均无统计学意义p>0.05)。(3)PTEN第4、5、8外显子测序结果分析数据表明：未发现在外显子上的突变。但有61例HCC样本检测出在第4外显子与第4内含子交界处发生大片段的缺失,缺失率为56.4%(61/108)。PTEN缺失率在在组A、组B、组C和组D中分别为60.4%(29/48)、62.9%(17/27)、47.3%(9/19)和46.6%(7/15),其差异在4个亚组间均无统计学意义p>0.05)。(4)蛋白表达方面,P53蛋白免疫组化表达阳性着色均定位在细胞核内。P53蛋白在108例HCC患者组织与20例正常组织中阳性表达率为76.8%(83/108)和10%(2/20),其差异具有显著性(p<0.001)。在组A、组B、组C、组D中的阳性率分别为87.5%(42/48)、66.7%(18/27)、78.9%(15/19)、42.9%(8/14)。其中,A组分别与B组、D组比较,其差异有统计学意义p=0.039；p=0.020)。(5)β-catenin蛋白免疫组化的阳性表达主要见于3种形式：定位在细胞膜、细胞浆和细胞核。β-catenin蛋白在108例HCC患者组织与20例正常组织中阳性表达率为70.0%(75/108)和15%(3/20),其差异具有显著性(p<0.001)。75例阳性表达中,14.6%(11/75)为细胞核阳性；57.3%(43/75)为细胞浆阳性；28.0%(21/75)为细胞膜阳性；3例正常肝组织都是包膜阳性。β-catenin蛋白在12例有突变的样本中表达阳性率为100%,其中8例为细胞浆阳性,1例细胞核阳性,3例细胞膜阳性。β-catenin蛋白表达在组A、组B、组C、组D中的阳性率分别为70.8%(34/48)、66.6%(18/27)、78.9%(15/19)、57.1%(8/14),其差异在4个亚组间均不具统计学意义p>0.05)。(6)RT-PCR的结果显示,β-catenin基因mRNA在4个亚组中表达的平均半定量灰度值分别为：组A：1.13土0.14；组B：1.06+0.12；组C：1.16土0.18；组D：1.01土0.13；正常对照组为0.085+0.13。其中,组A、组C分别与组D相比,其差异均具有统计学意义(p=0.028,p=0.032)。此外,四个亚组与正常对照组比较,其差异也均具有统计学意义(p<0.001)。PTEN基因mRNA在4个亚组中的表达半定量灰度值分别为：组A：0.54+0.13；组B：0.59+0.16；组C：0.97+0.16；组D：0.92+0.13。正常对照组为1.10+0.16。其中,组A、组B分别与组C及组D相比,其差异均具有统计学意义(p=0.002,p=0.032,p<0.001,p=0.011)。此外,组A、组B、组D与正常对照组相比,其差异也具有统计学意义(p<0.05)。结论1.广西壮族自治区人群肝细胞癌P53基因的突变具有多样性,其中P53-exon7249密码子突变为其突变热点,为广西地区肝癌人群中常见的分子生物学特征之一。2.P53基因的突变、β-catenin基因第3外显子突变可能是导致其基因过表达的因素之一；而PTEN基因的缺失可能是导致其表达下调的主要因素。3.P53基因、β-catenin基因的高表达率可能与广西地区黄曲霉毒素高暴露有关；而PTEN基因的失活则与该地区HBV高感染率有关。