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目的肾母细胞瘤又称肾胚胎瘤或Wilm氏瘤,是最常见的腹部恶性肿瘤,其发病率在小儿腹部肿瘤中占首位,占儿科恶性肿瘤的6%。根据文献报道,肾母细胞瘤中存在Bcl-2表达升高,p53变异,以及β-catenin激活,已知这几种分子均可通过调控自噬参与多种肿瘤的发生发展,故推测肾母细胞瘤存在自噬失调。细胞自噬是一种主要由溶酶体介导的细胞对内容物自我降解的过程,是细胞维持内环境稳态的一种保护性机制,但过度自噬对细胞有杀伤作用,已经被纳入为一种肿瘤的特征性活动。目前尚无关于自噬和肾母细胞瘤关系的相关报道。本研究探究肾母细胞瘤中自噬的特征性变化,自噬调控如何影响肾母细胞瘤增殖,意在进一步阐释肾母细胞瘤发病机理,并探索是否可以通过调控自噬水平,提出比传统治疗方案更高效低毒的抑瘤方案。材料和方法本研究采用细胞系G401(ATCC购进),组织标本采集：所有标本来自浙江大学医学院附属儿童医院组织标本库。所涉及的自噬调控药物以及化疗药物3-MA、CQ、Rapamycin、 VCR来自Sigma, Cayman等试剂公司,。所用特异性抗体以及HRP标记二抗：p62,Beclin1,LC3来自MBL,Sigma,Santa Crus,Invitrogen等试剂公司。1.了解肾母细胞瘤中的自噬水平。组织层面：RT-PCR法检测化疗后肾母细胞瘤组织以及癌旁相对正常肾组织中自噬相关基因LC3,BECLIN1,P62和ATG5mRNA水平的表达；应用免疫组化方法检测化疗前后,肾母细胞瘤组织以及癌旁相对正常肾组织LC3、Beclin1,p62蛋白水平的变化,以及耐药肿瘤组织中上述三种蛋白的表达；Western-blotting测化疗后肾母细胞瘤组织以及癌旁相对正常肾组织中自噬蛋白p62,Beclin1,LC3的水平。2.明确自噬调控能否协同常规化疗药(VCR)杀伤肾母细胞瘤细胞。选取肾母细胞瘤细胞G401,使用MTT法检测细胞活力。明确单用各自噬调控药物(CQ/3-MA/rapamycin)以及单用化疗药物对G401的生长抑制,比较联用自噬调控药物后常规化疗药对目的细胞杀伤效用的影响(与化疗药拮抗或者协同或叠加)。3.分析自噬调控药物(CQ/3-MA/rapamycin)以及化疗药(VCR)如何影响G401细胞自噬。选取合理的药物剂量,处理细胞24小时,用RIPA裂解液裂解细胞,提取细胞总蛋白,Western-blotting检测自噬蛋白p62,LC3水平,分析有效调控剂量。4.进一步验证自噬抑制是否影响肿瘤生长,以及药物作用是否通过自噬。应用慢病毒(带有GFP-SiRNA-ATG7)瞬时转染G401,有效下调ATG7后,用不同浓度的自噬诱导药物rapamycin,比较4TG7表达抑制组与对照组中rapamycm对细胞生长的抑制程度。结果1.组织层面：Q-PCR结果显示,相较于癌旁组织,癌组织：BECLIN1/P62/ATG5/LC3基因mRNA水平表达均增高(△CT根据三次实验结果用mean±SE法表示,通过T检验分析,P<0.05视为统计学差异具有显著性)。Western-blotting结果显示,相较于癌旁相对正常组织,治疗后癌组织Beclin1蛋白无明显改变,p62堆积,LC3Ⅰ和LC3Ⅱ增多。免疫组化半定量结果显示：治疗前的癌组织较正常组织Beclin1,p62,LC3蛋白表达均低,其中Beclin1显著。治疗后(化疗)癌组织Beclin1, p62, LC3水平均回升,且化疗耐药癌组织Beclin1, p62, LC3亦呈高水平。2.细胞层面：1.VCR20nM能产生对G401细胞50%左右的抑制率,而继续增加VCR浓度不能显著提高细胞抑制率。2.自噬抑制药物(3-MA/CQ)对G401有杀伤作用,小剂量有效；自噬激动剂rapamycin对G401亦有杀伤作用但抑制率不高,最大抑制率约为20%。3.VCR (20nM)联用自噬抑制药物(3-MA/CQ)以后,对G401的杀伤作用并无协同杀伤作用,甚至拮抗；而联用自噬诱导药物rapamycin后,对G401的杀伤明显提升,低剂量时联用协同作用最强。4. Western-blotting结果显示,在G401中,3-MA有效抑制自噬(上游)剂量为0.5mM; CQ有效抑制自噬(下游)剂量为10μM; Rapamycin有效促进自噬(上游)剂量为1μM;0-50nM VCR对自噬并无明显调控作用。3.自噬相关基因干扰：慢病毒(转染所需)本身对G401细胞生长有一定抑制作用。在此基础上,在下调ATG7以后,细胞生长进一步受到抑制,而rapamycin对ATG7敲减的G401的生长抑制比对照组明显减弱。结论1.未化疗儿童肾母细胞瘤普遍存在自噬抑制,化疗有激活自噬的作用,但对肿瘤细胞具有抑制作用或保护作用未知。自噬激活可能参与化疗抵抗。2.自噬抑制(CQ/3-MA与siRNA ATG7)可显著杀伤肾母细胞瘤细胞G401,自噬诱导(Rapamycin)对G401也有一定杀伤作用。3.自噬抑制药物(CQ/3-MA)联合传统化疗药VCR对肾母细胞瘤细胞无协同杀伤效应,甚至部分拮抗；而自噬诱导药物rapamycin联用20nMVCR对G401有明显协同杀伤效应。4.Rapamycin对G401的生长抑制作用是通过调控自噬。