本课题作为国家科技支撑项目《农药及内分泌干扰物的复合效应评估技术研究》(2006BAK02A02)的子课题,重点研究了有机磷农药毒死蜱(chlorpyrifos,CPF)染毒一段时间后撤除对海马神经元的毒性作用与作用机制,以及海马神经元对CPF的耐受作用,为有机磷农药的慢性神经毒性作用机制研究提供理论依据;并研究了氨基甲酸酯农药克百威(carbofuran,CBF)预处理对CPF细胞毒性的影响及作用机制,以及氧化应激在该过程中的作用,为氨基甲酸酯农药与有机磷农药联合作用提供依据。1.毒死蜱撤除引起的海马神经元毒性与ERK1/2磷酸化抑制及乙酰胆碱神经系统功能不足有关有机磷农药诱导的慢性神经毒性(organophosphate induced chronicneurotoxicity,OPICN)具有迟发性,并持续很长时间,机制不明。为探讨这种慢性神经毒性的作用机制,本文研究了CPF撤除对原代培养海马神经元的毒性作用及相关机制。结果显示,10μM CPF连续染毒达96 h未产生明显细胞毒性,但在染毒48 h后将CPF撤除,却可导致明显的细胞毒性,表现为撤除CPF后24或48 h(自染毒计时为72 h或96 h),神经元MTT代谢降低,神经元缺失增加,TUNEL阳性细胞增加。10μM CPF染毒对神经元胆碱酯酶(AChE)活性产生抑制作用,在CPF撤除后,AChE活性轻度升高,提示由CPF撤除引起的细胞毒性不是AChE抑制的直接结果。CPF染毒可使ERK1/2经磷酸化激活,在CPF存在的情况下,这种激活作用可持续数小时,以后逐渐恢复正常,染毒48 h后CPF撤除使ERK1/2磷酸化受到抑制。氨甲酰胆碱与神经生长因子(NGF)可激活ERK1/2,对CPF撤除后的细胞具有保护作用;阿托品与PD98059抑制ERK1/2磷酸化,加重了CPF撤除后的细胞毒性,显示抑制ERK1/2磷酸化在CPF撤除导致的细胞毒性中起重要作用。氨甲酰胆碱是一种胆碱能激动剂,阿托品是胆碱能拮抗剂,两者对CPF撤除后细胞毒性以及AChE的变化都提示CPF撤除引起了乙酰胆碱神经系统功能不足。结论:10μM CPF连续染毒96h无细胞毒性,但染毒48 h后撤除导致明显的细胞毒性,这种细胞毒性不是AChE抑制所致,而与ERK1/2磷酸化抑制及乙酰胆碱神经系统功能不足有关。提示CPF撤除可能引起戒断反应,有机磷农药的慢性神经毒性可能与戒断作用有关。2.海马神经元对毒死蜱的耐受作用研究在研究1中发现,无细胞毒性浓度的CPF染毒一段时间后撤除可以导致细胞毒性,提示有机磷农药可能会产生戒断毒性。由于耐受作用往往是戒断作用的前提,为进一步探讨有机磷农药的毒性作用机制,有必要对有机磷农药的耐受作用进行深入研究。我们采用无细胞毒性浓度(10μM)CPF对培养海马神经元预处理染毒48 h,再经较高浓度的CPF(30,60,100 gM)染毒48 h,通过测定细胞存活率、LDH漏出率以及Tunel阳性细胞率,比较是否CPF预处理一段时间可以降低较高浓度CPF对细胞的毒性作用。结果:经10μM CPF预处理组比未经预处理组细胞存活率上升、LDH漏出率下降、Tunel阳性细胞率下降,表明经预处理的细胞对较高浓度的CPF产生了耐受作用。本研究进一步提示CPF撤除引起的细胞毒性作用是一种戒断反应,提示有机磷农药导致的慢性神经毒性可能与戒断反应有关。3.氨基甲酸酯农药克百威预处理对有机磷农药毒死蜱神经细胞毒性的影响农业生产中大量使用有机磷农药与氨基甲酸酯农药,使得人类暴露于这两类农药的机会增加,尤其是可在不同时间暴露于这两类农药,从而产生联合作用。为探讨这两类农药的联合作用与机制,我们研究氨基甲酸酯农药CBF预处理对有机磷农药CPF神经细胞毒性的影响。方法:采用MTT法测定CBF处理后原代培养皮层神经细胞存活率,找出无细胞毒性浓度;采用无毒浓度的CBF对培养细胞进行不同时间的预处理,再加入CPF染毒48 h(同时存在CBF)测定细胞毒性变化;采用Western blot方法研究CBF不同时间预处理对CPF激活ERK1/2作用的影响。结果:10μM CBF染毒72 h显示无细胞毒性,10μM CBF预处理2～24 h可减轻60μM CPF的毒性,预处理8 h作用最强;CBF预处理降低了CPF对ERK1/2的激活作用,抑制ERK1/2激活作用与细胞毒性减轻相关。而CBF与CPF同时染毒(预处理0h)对CPF的细胞毒性及ERK1/2激活影响很小。结论:CBF预处理一段时间后可拮抗CPF的细胞毒性,作用机制与抑制ERK1/2激活有关,而CBF预处理时间过短,则不产生拮抗作用。提示氨基甲酸酯农药与有机磷农药之间的联合作用模式受两者暴露时间间隔影响。4.克百威预处理对毒死蜱致皮层神经细胞氧化应激作用的影响在前面的研究中,10μM CBF对皮层神经细胞预处理8 h可显著减轻CPF的细胞毒性,由于氧化应激作用与农药的毒性有关,本研究进一步探讨了氧化应激在该过程中的作用,以揭示有机磷农药与氨基甲酸酯农药联合作用的机制。方法:以10μM CBF染毒原代培养皮层神经细胞8 h,测定丙二醛(MDA)水平、谷胱甘肽(GSH)水平、超氧化物岐化酶(SOD)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性;以10μM CBF对皮层神经细胞染毒8 h后,再以不同浓度CPF(20、40、60、80μM)染毒24 h,测定上述氧化应激指标。结果:CBF染毒8 h,可使MDA水平轻度增加,SOD、GSH-PX活性升高,GSH水平无显著变化;在无CBF预处理情况下,CPF染毒可使皮层神经细胞MDA水平增加,GSH水平下降,SOD、GSH-PX活性下降,呈现明显的浓度-效应关系,表明CPF可使神经细胞产生明显的氧化应激作用。CBF预处理对CPF所致氧化应激作用产生影响,与未经CPF预处理组比较,CBF预处理组MDA下降,GSH水平有所升高,SOD、GSH-PX活性升高,表明经CBF预处理的细胞对CPF的氧化损伤具有抵抗作用。结论:CBF预处理可拮抗CPF的脂质过氧化损伤作用,作用机制可能与CBF诱导产生轻度的氧化应激作用,在产生轻度过氧化损伤导致MDA升高的同时,增强了细胞的抗氧化能力有关,提示氧化应激作用参与了农药之间的联合作用机制。结论:1.CPF可诱导海马神经元的耐受作用,以无毒性作用浓度的CPF染毒一段时间后撤除可产生细胞毒性,这种CPF撤除所致细胞毒性作用与ERK1/2磷酸化抑制及乙酰胆碱神经系统功能不足有关,提示有机磷的慢性神经毒性可能与戒断作用有关。2.以无细胞毒性作用浓度的CBF预处理一段时间后可以拮抗CPF对皮层神经细胞的毒性作用,作用机制与CBF预处理可以抑制CPF的ERK1/2激活作用及减轻了CPF所致氧化应激作用有关。提示氨基甲酸酯农药与有机磷农药之间的联合作用模式受两者暴露时间间隔影响。