玉米秸秆较经济的处理方式是运用生物转化方法发酵处理,使之成为优质牛羊生物粗饲料,玉米秸秆中木质素难以降解直接影响了纤纤维素和半纤纤维素的降解和转化,是秸秆饲料化生产过程中最大的难点之一。自然界中的白腐真菌分泌的锰过氧化物酶（manganese peroxidase,Mn P）是一种高效的木质素降解酶,但白腐菌生长过慢,产Mn P需要诱导,如果直接用于发酵会增加时间和成本。目前,构建食品级重组菌有效分泌木质素酶用于降解玉米秸秆木质素的报道几乎还没有,本研究构建一株高比酶活的具生物安全性的饲用锰过氧化物工程菌,促进秸秆饲料发酵产业化。本文将白囊耙齿菌中锰过氧化物酶基因mnp（Gen Bank:MH120207.1）序列经密码子优化后构建E.coli p ET-28a-mnp重组菌株,经0.5 m M IPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测显示:重组Mn P分子量约为43 k Da,为部分可溶性表达。通过Ni-NTA亲和层析得到纯品蛋白,以愈创木酚为底物,测得Mn P的酶活力为24 U/mg。酶学性质分析表明:重组Mn P的最适反应温度为40℃,最适反应p H为3.0,在20～50℃、p H 2.5～3.5范围内稳定性较好。当添加的金属离子浓度为10 m M时,Ca2+、Mg2+对重组酶酶活有促进作用,分别可提高酶活性53%和30%;另外,Fe2+、Cu2+在10、5、1 m M离子浓度下均对重组酶有明显的抑制作用。粟酒裂殖酵母真核表达系统经过翻译后修饰从而正确折叠异源表达蛋白,分泌具有活性和天然构象的蛋白。将mnp和穿梭质粒载体p REP连接,构建原核-真核穿梭质粒p REP-mnp,通过电转法将重组穿梭质粒导入粟酒裂殖酵母中,获得了重组酵母S.pombe-p REP-mnp菌株。经YES液体扩培至平台期,通过超滤管浓缩收集培养液中重组菌分泌表达的胞外蛋白。经过SDS-PAGE电泳检测mnp基因在粟酒裂殖酵母真核表达系统中成功表达,重组Mn P的表观分子量约为43 k Da。经测定发现重组酵母胞外分泌的Mn P在第4 d时酶活力急剧上升,达到酶活最大值17.46 U/L。以重组Mn P酶活力为指标,探究小分子物质对重组Mn P氧化愈创木酚的影响,发现添加草酸、丙二酸、没食子酸和ABTS对Mn P酶活性均有明显地激活作用,其中ABTS促进最为显著,其次是草酸、丙二酸、没食子酸,苯酚和2,6-二甲基苯酚对重组Mn P的酶活力的提高不明显,单宁酸对重组酶有明显的抑制作用。探究重组MnP对秸秆木质素的多酶协同降解的影响,确定最佳多酶协同条件:料液比例为1:1,Ca Cl2添加量为0.5%,漆酶（10 000 U/g）添加量为1%,Mn SO4添加量为0.3%,葡萄糖氧化酶（200 U/g）添加量为0.4%,静置于40℃恒温恒湿培养箱中酶解反应72 h后,玉米秸秆中木质素降解率达到53.97%。再探究小分子物质对木质素降解的影响,确定在多酶协同过程中添加0.5 m M草酸和0.02%的Tween-80复配以提高木质素降解效率,在最佳条件下酶解反应72 h后玉米秸秆中木质素降解率达到65.85%。最后探究菌酶协同发酵玉米秸秆,确定最佳发酵条件为:接入S.pombe-p REP-mnp、N.crassa和S.pombe-man 12 h后再接入C.utilis四种菌混合进行固态发酵,菌液总接种量为12%;0.5%尿素和2%硫酸铵作为氮源;添加终浓度0.5 m M草酸和0.02%Tween-80作为复配小分子激活剂;再添加0.5%Ca Cl2,1%漆酶,0.3%Mn SO4,0.4%葡萄糖氧化酶。固态发酵试验中总含水量为65%,30℃发酵3 d。测得木质素、半纤维素和纤维素的降解率分别为60.79%、27.61%和25.49%,真蛋白含量提高了310.99%。本研究构建一株高比酶活的锰过氧化物酶酵母工程菌,并提供了一种经济高效安全的多酶及菌酶协同发酵方案,短时间内显著改善玉米秸秆发酵效果,为玉米秸秆转化成高品质生物饲料产业化提供参考。