构建靶向EGFR的纳米载药体系及对食管癌的协同治疗

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目的:食管癌是全球范围内常见的消化道恶性肿瘤,而中国是食管癌高发国家,其发病率和死亡率居高不下,约占全球的一半;在国内,山西又是食管癌高发地区。碳纳米点(碳点)因其具有突出的光致发光性能,良好的生物相容性及表面富含官能团易功能化等特点,备受科研工作者关注,已被广泛应用到了传感、生物成像和药物递送等各个领域。针对临床上食管癌治疗手段单一且预后差等问题,本文充分利用碳点的优点负载化疗药物、光敏剂以及靶向单元,成功构建一个可主动靶向递送药物、多种手段协同治疗食管癌的纳米载药体系,主要内容如下:1.以对氨基苯甲酰胺和对氨基水杨酸为原料,通过水热法合成可发绿色荧光的碳点GCDs,然后对其结构和组成进行表征。2.通过化学键的连接,在上述合成的GCDs上接枝顺铂前药、光敏剂二氢卟吩e6(Ce6)及靶向单元重组人表皮生长因子EGF,构建可主动靶向食管癌细胞的纳米载药体系(GCDs-Ce6/Pt-EGF),并且对其进行结构表征及性能检测。3.研究细胞对纳米载药体系的摄取能力以及纳米药物的靶向能力和细胞毒性;建立食管癌动物模型,研究纳米药物活体靶向成像能力、靶向化疗及光动力协同治疗效果。方法:1.以对氨基苯甲酰胺与对氨基水杨酸为原材料经优化合成条件后一步水热法合成GCDs,通过TEM、AFM、XRD、XPS和FTIR等手段对GCDs的结构和组成进行表征。利用紫外可见分光光度计,荧光分光光度计分析其光学性质,同时通过其荧光变化探究离子强度、p H、照射时间和储存时间对其稳定性的影响。随后探究GCDs的离子选择性及细胞毒性。2.合成顺铂前药(记为Pt(IV)),通过酰胺反应在GCDs上枝接Ce6、顺铂前药及EGF,通过紫外-可见吸收光谱、FTIR、TEM及Zeta等方法对其进行表征。然后利用活性氧探针对复合物的体外光动力性能进行研究。3.将纳米药物作用于食管癌细胞(KYSE-150),通过激光共聚焦成像、细胞流式技术观察细胞对药物的摄取情况;利用MTT、细胞流式、Calcein-AM/PI等探究GCDs-Ce6/Pt-EGF对KYSE-150的杀伤作用。建立食管癌动物模型,将GCDs-Ce6/Pt-EGF经尾静脉给药注入裸鼠体内,然后通过小动物活体荧光成像仪观察药物在体内的分布及代谢情况。治疗周期结束后,通过肿瘤体积变化评估治疗效果,根据小鼠体重变化、生化指标以及各器官组织切片分析纳米药物的生物安全性。结果:1.合成的GCDs呈准球形,平均粒径4.72 nm,带正电,表面富含多种官能团,有较好的光稳定性,能特异选择性识别铁离子,且检出限为1.28μmol/L。MTT实验表明GCDs具有低毒性。2.成功合成顺铂前药Pt(IV)并载入纳米体系。通过粒径变化、电位变化、紫外-可见光吸收光谱等手段研究,证明GCDs-Ce6/Pt-EGF的成功构建并且有较好的光动力性能。3.激光共聚焦细胞成像及细胞流式实验结果表明KYSE-150细胞能很好地摄取纳米药物,纳米药物对其具有明显的靶向性。在660 nm激光照射下,Ce6可产生活性氧,相对于对照组,Ce6与顺铂联合对KYSE-150细胞的杀伤效果显著。通过小动物活体荧光成像发现纳米药物在肿瘤部位明显聚集,说明其具有专一的靶向能力;通过对模型裸鼠的治疗研究,与对照组相比纳米药物对肿瘤治疗效果显著。最后研究治疗期小鼠体重变化、血液生化分析及组织病理切片等,表明GCDs-Ce6/Pt-EGF载药体系具有很好地生物安全性。结论:本工作通过在合成的GCDs上接枝化疗药物顺铂、光动力试剂Ce6以及靶向单元EGF,成功构建可主动靶向成像和集靶向化疗与光动力为一体的协同治疗食管癌的纳米载药体系,并应用于在细胞、动物成像及食管癌的治疗,效果显著,为临床提供了一种靶向协同治疗食管癌的新策略。
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