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研究目的:利用基因重组技术,构建SSA-60蛋白表达载体,在大肠埃希菌中诱导表达,纯化获得具有生物活性的SSA-60重组蛋白;以自制的SSA-60重组蛋白为原料,建立抗SSA-60抗体磁微粒化学发光定量检测方法,并对其性能进行系统评价。研究方法:1以Hela细胞提取RNA后逆转录的cDNA为模板,利用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增带酶切位点BamH I和Xho I的人干燥综合症A抗原(Sj?gren,s syndrome type A,SSA)蛋白基因序列,经酶切后插入PET41a质粒中,构建成GST-SSA-6*His-pet41a重组表达质粒,转化入Rosetta(DE3)中,经异丙基β-D-半乳糖苷(Isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,利用亲和层析纯化,用聚丙烯酰氨凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)鉴定重组蛋白表达形式;用蛋白免疫印迹(Western Blotting,WB),酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assays,ELISA)方法鉴定重组蛋白的特性。2以我们自制的SSA-60重组蛋白为原料,建立磁微粒化学发光法定量检测抗SSA-60方法。经条件优化后,进行系统的性能评价,评价是否符合临床要求。结果:1 PCR扩增获得目的基因,经双酶切凝胶电泳显示重组表达质粒构建成功,转化Rosetta(DE3)菌种后,诱导表达,SDS-PAGE显示SSA-60重组蛋白为包涵体表达。经WB,ELISA验证纯化的SSA-60重组蛋白具有很强免疫原性和蛋白活性。2经条件优化和性能评价,本方法的方法检出限(Method Detection Limit,MDL)=1.36 RU/mL,定量测定下限(Reliable Quantitation Limit,RQL)=4.48 RU/mL;精密度(CV)均<10%;与其他自身抗体线无明显的交叉反应;线性范围是2-400 RU/mL,具有更宽的线性范围,明显优于传统的ELISA法。在与ELISA对比实验中,两种检测方法的标准误差(SE)是31.3,且两者具有良好的相关性(y=1.04x-7.86,R~2=0.9785,P<0.05)和较高的一致性(配对卡方检验,P=0.508,>0.05,K=0.949)结论:1成功制备了纯度高,特异性好及蛋白活性好的重组SSA-60抗原,为应用于国产仪器的磁微粒化学发光法提供了有利的条件。2磁微粒化学发光法定量检测抗SSA-60抗体具有高灵敏度,强特异性和更宽的线性范围。与ELISA法对比,两者具有很好的一致性和相关性。本方法在快速、高通量、定量和自动化检测自身免疫抗体等方面有着巨大的潜力,也为其他自身抗体建立磁微粒化学发光法定量检测,奠定基础。