近年来,众多学者都在尝试利用斑马鱼这种模型生物进行神经发生以及神经损伤修复的研究。转录因子Gata3以及Neurog1被证实在斑马鱼新生神经元的增殖,分化以及迁徙中扮演重要角色,并且它们均只在胚胎期中表达,而在正常成年斑马鱼中基本不表达。当成年斑马鱼脑部或脊髓等其它部位在较大损伤诱导下,Gata3基因会迅速表达,最后呈现损伤部位高表达。Neurog1基因会在增殖分化的中间祖细胞中表达,并促进该神经元的分化。因此,通过对Gata3和Neurog1基因进行荧光标记,并进行活体追踪定位,对于研究斑马鱼胚胎早期神经发育以及损伤诱导下神经修复机制的研究具有重要意义。此前,基于基因捕获技术找到并建立起了一些标记特殊神经组织和神经元的斑马鱼品系对于斑马鱼的神经生物学研究起到了至关重要的作用。然而,这些品系多少都存在一些缺陷如不能精确定位等。随着基因编辑技术的发展,特别是常间回文重复序列丛集关联蛋白系统(简称CRISPR/Cas系统)精确定点敲入技术的问世,使我们对于斑马鱼特殊基因的精确标记成为可能。为了建立斑马鱼神经发育与神经损伤修复实时监测模型,我们使用CRISPR/Cas9系统,在不影响基因表达的前提下分别在Gata3和Neurog1基因的终止子前插入p2A-mEOS3.2可光转荧光蛋白的DNA序列,最后通过捕获mEOS3.2荧光蛋白的信号我们便可以追踪定位到Gata3和Neurog1表达的蛋白质。最终,我们分别成功构建了 Gata3-p2A-mEOS3.2和Neurogenin1-p2A-mEOS3.基因敲入(KI)斑马鱼品系,同时实现了对斑马鱼胚胎早期Gata3以及Neurog1基因表达的活体观察。这些实验对斑马鱼早期神经发育的研究具有重要意义。同时我们还尝试对成体斑马鱼端脑进行损伤诱导实验,通过捕获mEOS3.2荧光信号,我们成功监控到了不同时间点上的Gata3和Neurog1基因表达情况。成体斑马鱼神经损伤修复的实时监测模型的成功建立,为斑马鱼在损伤诱导下由神经发生引起的损伤修复的研究提供了技术支持。在初步探索中我们发现,Gata3和Neurog1基因主要在损伤部位以及干细胞富集区域表达丰富。同时发现,在Neurogenin1-p2A-mEOS3.2基斑马鱼KI品系中,能明显观察到表达Neurog1基因的细胞会在端脑损伤区域以及中脑端脑交汇处的干细胞富集区域呈现搭桥现象,此现象或许是干细胞富集区域的新生神经元向损伤区域迁徙导致的。本项目的研究结果对于今后人们深入研究斑马鱼早期神经发育以及揭示成体神经发生和神经损伤修复机制具有重大意义。