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目的:脑血管病是现阶段全世界范围内威胁人类健康,影响人类寿命的常见疾病之一。缺血性脑卒中（ischemic stroke,IS）是脑血管病中最常见的类型,患病人数约为脑血管病患者总数的80%,其病理机制可能是由于脑部血液供应受阻,进而导致脑组织缺血、缺氧,造成脑组织坏死、水肿等,影响正常的神经功能。缺血性脑卒中的致死率高,致残率更高,该病患者的生活质量可能受到严重的影响。迄今为止,国际上唯一公认的缺血性卒中治疗方式是血管再通治疗。然而,由于患者及其家属对缺血性脑卒中的早期临床表现不了解,没有及时就医,错过了最佳的血管再通治疗机会,疾病的预后可能会很差。此外,血管再通治疗后或者未经血管再通治疗的保守治疗过程中,可能出现脑缺血再灌注损伤,病情将进一步加重。因此,现阶段探索缺血性脑卒中早期诊断及有效的治疗方法迫在眉睫。脑缺血再灌注损伤诱导的神经元死亡是危害神经功能的最直接因素。在发生脑缺血再灌注损伤时,由于血脑屏障破坏、神经兴奋毒性、神经炎症等原因,神经元内会堆积过量的活性氧片段（Reactive oxygen species,ROS）、活性氮片段（Reactive nitrogen species,RNS）等自由基,损伤神经元中的细胞器、DNA、脂质等,进而引发神经元死亡。而在形态学表现上,神经元出现细胞缩小、核固缩、DNA片段化、细胞肿胀、破裂等多种多样的表现,说明脑缺血再灌注损伤过程中多种细胞死亡形式同时存在。近年来,研究发现,一种新型的程序性细胞死亡形式——铁死亡,参与到脑缺血再灌注损伤的发病机制中。铁死亡的发生与铁超载介导的脂质活性氧类堆积有关。作为铁死亡的始动因素,铁离子在细胞内的堆积对铁死亡的触发非常关键,细胞内过多的游离亚铁离子可以促进脂质过氧化,而当谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione Peroxidase 4,GPX4）失活时,细胞膜的多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid,PUFA）氧化失调,启动细胞发生铁死亡。目前认为脂质氧化失调和脂质活性氧的形成最终将导致细胞膜损伤和穿孔,但导致这种损伤出现的确切分子机制仍不清楚。六跨膜前列腺上皮抗原4（six transmembrane epithelial antigen of the prostate4,STEAP4）,基因位于7q21.12,表达的蛋白可能具有金属还原酶功能,可以将细胞内NADPH的电子转移给细胞外的铁离子或铜离子。在破骨细胞分化的研究中,发现Steap4可以促进细胞内铁离子增高,促进破骨细胞分化。在小鼠肠炎模型中,Steap4高表达,使线粒体铁超载,在肠炎的发展中起到重要的促进作用。但Steap4在急性缺血性脑卒中的表达情况以及发挥的生物学作用,目前国内外尚无相关文献报道。本研究初步探讨了Steap4在脑缺血再灌注损伤后的表达变化,及其对脑缺血再灌注损伤诱导的神经元铁死亡的潜在调节机制。研究方法:一、建立脑缺血再灌注损伤动物模型及细胞模型,分析Steap4在疾病模型中的表达水平。1、建立小鼠短暂性大脑中动脉闭塞（transient middle cerebral artery occlusion,tMCAO）模型,应用TTC染色检测脑梗死体积;应用ELISA实验检测假手术组和疾病组小鼠血清中Steap4的表达情况;应用qRT-PCR及Western Blot方法分别检测各组小鼠脑组织中Steap4的mRNA与蛋白表达水平;应用免疫荧光法分别双染各组小鼠脑组织的神经元标志物Neu N和Steap4,观察Steap4表达的组织细胞分布情况。2、建立N2a细胞氧糖剥夺复氧（oxygen and glucose deprivation reoxygenation,OGD/R）模型,应用qRT-PCR及Western Blot方法分别检测各组细胞中Steap4的mRNA与蛋白表达水平差异。二、研究Steap4对脑缺血再灌注损伤神经元铁死亡的影响。1、在N2a细胞OGD/R模型中,应用siRNA转染的方法敲减Steap4,应用过表达质粒转染的方法过表达Steap4。2、通过CCK8法检测细胞活力变化;通过检测LDH反映细胞损伤情况。3、通过Western Blot实验检测各组细胞中铁死亡相关蛋白GPX4、SLC7A11、DMT1、FPN1的表达差异;应用铁检测试剂盒检测细胞中铁含量差异;通过2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）探针检测细胞中活性氧簇（ROS）的改变;应用GSH、MDA试剂盒检测细胞中GSH和MDA的含量变化。三、Steap4加重脑缺血再灌注损伤神经元铁死亡的机制研究。1、在N2a细胞OGD/R模型中敲减与过表达Steap4,通过Western Blot检测pp38、p-JNK、p38、JNK的蛋白表达变化。2、在N2a细胞OGD/R模型中,在过表达Steap4的同时分别加入p38的抑制剂SB202190和JNK的抑制剂SP600125,应用CCK8法检测细胞活力;通过检测LDH反应细胞死亡情况。通过Western Blot实验检测各组细胞中铁死亡相关蛋白GPX4、SLC7A11、DMT1、FPN1的表达差异,以明确Steap4促进铁死亡是否部分依赖于p38/JNK信号通路的激活。结果：1、在tMCAO小鼠血清中Steap4蛋白表达明显高于假手术组;在tMCAO小鼠脑组织中,Steap4的mRNA和蛋白表达水平均高于假手术组;免疫荧光双染结果显示,在tMCAO小鼠缺血半暗带脑组织神经元中,Steap4蛋白的表达水平高于假手术组。2、在N2a细胞OGD/R损伤后,Steap4的mRNA和蛋白表达水平均高于正常对照组。3、转染Steap4siRNA-1及Steap4siRNA-2能够降低OGD/R细胞中Steap4的蛋白表达水平;敲减Steap4可以减轻OGD/R诱导的神经元损伤,增强细胞活力;敲减Steap4可以降低OGD/R神经元中的铁含量,增加GPX4、SLC7A11、FPN1的蛋白表达,降低DMT1的蛋白表达,降低细胞中ROS的含量,增加细胞内GSH的含量以及降低MDA的表达,说明抑制Steap4可以抑制脑缺血再灌注损伤造成的神经元铁死亡。4、转染Steap4质粒能够显著上调Steap4的蛋白表达水平。过表达Steap4可以增强OGD/R诱导的神经元损伤,降低细胞活力;过表达Steap4可以增加OGD/R神经元中的铁含量,降低GPX4、SLC7A11、FPN1的蛋白表达,增加DMT1的蛋白表达,增加细胞中ROS的含量,降低细胞内GSH的含量以及增加MDA的表达,说明Steap4可以促进脑缺血再灌注损伤诱导的神经元铁死亡。5、在OGD/R损伤时,敲减Steap4可以抑制p38和JNK蛋白磷酸化,过表达Steap4可以促进p38和JNK蛋白磷酸化。6、在OGD/R损伤时,过表达Steap4的同时分别加入p38的抑制剂SB202190和JNK的抑制剂SP600125后,与单纯过表达Steap4组相比,神经元死亡减少,细胞活力增加,铁死亡相关蛋白GPX4、SLC7A11、FPN1表达增加,DMT1表达降低。提示Steap4可以通过激活p38/JNK信号通路促进脑缺血再灌注损伤时神经元铁死亡。结论:1、Steap4在小鼠tMCAO模型的血清和脑组织神经元中高表达,在N2a细胞OGD/R模型中高表达。2、在OGD/R时,敲减Steap4可以缓解神经元铁死亡,增强细胞活力;过表达Steap4可以促进神经元铁死亡,抑制细胞活力。3、Steap4可以通过激活p38/JNK信号通路从而加重神经元铁死亡;应用p38和JNK的抑制剂可以部分逆转Steap4诱导的神经元铁死亡。