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局部及全身的黏膜免疫反应,特别是黏膜表面的分泌型IgA (SIgA),对抵御经呼吸道、消化道或泌尿生殖道等黏膜表面入侵的病原体有着非常重要的作用。流感病毒是典型的经呼吸道传播的病毒,2009年甲型H1N1流感病毒的全球爆发再次向我们提示流感疫苗研发及生产的重要性。目前我国应用的甲型流感疫苗为注射用病毒裂解疫苗,如果能够研发出经黏膜途径(如喷鼻)免疫的流感蛋白亚单位疫苗,不但能够取消注射接种的麻烦,还能够摆脱疫苗生产对鸡胚的依赖,更适合我国人口众多、经济发展不平衡的现实国情。引发黏膜免疫应答最有效的方式就是将疫苗直接接种到黏膜表面,但是黏膜免疫短时应答、弱势应答的特点制约着黏膜疫苗的发展,有效的黏膜佐剂或黏膜递送系统的研发对弥补这两个弱点和推广黏膜疫苗的应用具有非常重要的作用。化合物48/80(Compound 48/80,简称C48/80)是一种新发现的具有黏膜佐剂效果的物质,本研究中将重组的甲型H1N1流感病毒(A/California/04/2009)血凝素(HA)蛋白与C48/80佐剂配伍制备成甲型流感蛋白亚单位疫苗,经滴鼻方式免疫小鼠,3次免疫后小鼠血清中产生了HA特异性的IgG抗体,免疫小鼠的肺、鼻、阴道盥洗液及粪便提取液中也检测到了特异性IgA的存在。体外微量中和试验证实,小鼠血清中的特异性抗体具有中和甲型H1N1流感病毒(A/California/04/2009)的能力。随后的攻毒试验表明,该亚单位疫苗对小鼠具有较好的保护作用,90%的小鼠能够经受致死量(1×106TCID50)同型病毒的攻击存活。由于C48/80的佐剂作用与它刺激肥大细胞脱颗粒的能力相关,我们推测另外一种能使肥大细胞活化的物质Mastoparan (MP)也可能具有一定的黏膜佐剂作用。我们将不同剂量的MP与HA蛋白配伍,滴鼻免疫小鼠,实验结果显示,随着MP剂量的增加,小鼠体内血清中HA特异性IgG抗体的滴度也随之升高,当MP佐剂剂量为10μg时,小鼠黏膜盥洗液和粪便提取液中能检测到HA特异性IgA的存在,攻毒试验中小鼠的存活率达到了100%。对小鼠血清中总IgE含量的测定发现,这两种佐剂对小鼠血清中总IgE的含量没有显著影响,用ELISA方法没有检测到血清中HA特异性IgE的存在。另外,免疫了含C48/80或MP佐剂的小鼠体内能够检测到Thl和Th2类细胞免疫应答,小鼠鼻粘膜表面观察到了肥大细胞脱颗粒现象。以上结果表明,以C48/80及MP为佐剂的甲型H1N1流感蛋白亚单位疫苗,能够保护小鼠经受致死量(1×106TCID50)同型病毒的攻击,C48/80及MP这两种佐剂在流感蛋白亚单位疫苗中发挥了有效的黏膜佐剂作用,小鼠免疫了含有这两种佐剂的疫苗后血清总IgE抗体水平未见增高。MP佐剂的作用机制可能与C48/80一样都与肥大细胞相关。本课题的创新性主要体现在三个方面：一是证实了C48/80这种肥大细胞激活剂类黏膜佐剂在流感蛋白亚单位疫苗中的黏膜佐剂效果,并首次发现了MP的黏膜佐剂活性；二是证明了HA蛋白与C48/80或MP佐剂配伍而成的甲型H1N1流感蛋白亚单位疫苗能够有效诱导小鼠产生保护性免疫应答；最后,这种蛋白亚单位疫苗通过滴鼻方式免疫,无须针剂注射,不依赖鸡胚生产,适合我国现阶段基本国情,有继续研发的价值。