硫酸软骨素/硫酸皮肤素（Chondroitin sulfate,CS/Dermatan sulfate,DS）是由葡萄糖醛酸（GlcUA）/艾杜糖醛酸（IdoUA）和N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）组成的二糖单元经β1-4糖苷键重复连接而成的聚阴离子直链多糖,二糖单元不同程度的硫酸化使得CS/DS糖链复杂化,高度复杂的糖链结构严重阻碍了 CS/DS的结构与功能研究。CS/DS降解酶是CS/DS结构和功能研究必不可少的工具酶,目前可利用的CS/DS降解酶依然非常有限,因此寻找新型CS/DS降解酶具有十分重要的意义。哺乳动物肠道中存在大量的多糖降解菌,是挖掘新型多糖降解酶的巨大的资源宝库。在本研究中,我们通过长期喂食小鼠CS-A驯化肠道菌群,结合唯一碳源体外培养,富集肠道CS/DS降解菌,利用宏基因组测序,获得大量CS/DS降解酶疑似基因,并对其中两个新型硫酸软骨素/硫酸皮肤素裂解酶（CSly1和CSly2）和一个硫酸酯酶（SF2）进行了深入研究,具体结果如下:硫酸软骨素/硫酸皮肤素裂解酶CSly1:csly1基因全长为3087 bp,GC含量为54.10%,编码了一个含1068个氨基酸的蛋白,等电点为6.99。Blast多序列比对表明,CSly1一级序列中含有裂解酶催化模块,虽然其归属于多糖裂解酶超家族8（PL-8）,但与已鉴定的CS/DS裂解酶序列相似度很低（32%）。酶学特性及底物降解模式分析结果显示,CSly1能够以HA和CS/DS为底物,且在降解过程中仅能够产生不饱和二糖产物,这表明CSly1是一种外切型的CSase ABC。CSly1的最适反应条件为40℃和50 mM NaAc-HAc（pH 6.0）,且多种金属离子K+、Ca2+、Mg2+和Ba2+对其酶活力均有显著的促进作用,经测定,CSly1对HA、CS-A、CS-C、CS-D、CS-E以及DS底物表现出不同的比酶活,分别为 79mU/mg,88mU/mg,572mU/mg,936mU/mg,2574mU/mg,2250mU/mg。很显然,该酶倾向于降解高硫酸化的CS-D和CS-E以及DS,非常不同于已鉴定的其它CSase ABC,具有很大的新颖性。此外,CSly1可以降解还原端通过2-AB荧光标记的CS-A八糖,产生CS-A六糖和CS-A四糖,但不能降解CS-A四糖和HA四糖,表明还原端荧光标记对抑制CSly1的降解活性。总之,作为一个新型外切型CSase ABC,该酶在CS/DS糖链的构效关系研究和特殊结构寡糖的酶法测序中具有重要的应用潜力和研究价值。硫酸软骨素/硫酸皮肤素裂解酶CSly2:csly2基因序列由2250个碱基组成,其中GC含量为58.57%,编码了一个含2250个氨基酸的蛋白,等电点为8.85。Blast分析表明,CSly2归属于多糖裂解酶超家族8（PL-8）。CSly2的最适反应条件为40℃和50 mM NaH2PO4-Na2HPO4（pH 8.0）,K+、Na+、Ca2+、Mg2+等金属离子可以提高酶促反应的降解速率。CSly2可以降解HA和CS/DS,但不同于典型的CSase ABC降解HA的活性一般相对CS/DS底物会很低,其对HA具有更好的降解活性,为5.301 U/mg,而对CS-A、CS-C、CS-D 以及 DS 的比酶活分别为 1155 mU/mg,835 mU/mg,507 mU/mg,2028 mU/mg。与CSly1不同的是,其产物除了有不饱和二糖,还有寡糖产生,这表明是一种内切型的CSase ABC,CS/DS寡糖制备和结构研究中具有重要应用价值。硫酸酯酶SF2:sf2基因序列全长1467 bp,其中GC含量47.03%。SF2等电点为6.83。硫酸酯酶一级结构多序列比对分析结果表明,SF2与CS/DS 2-O-硫酸酯酶聚类,而与4-O-硫酸酯酶和6-O硫酸酯酶的同源性极低,推测SF2是2-O-酼酸酯酶。SF2最适反应条件为40℃和50 mM Tris-HCl（pH 9.0）,Na+、K+、Ca2+、Ba2+、Mg2+等金属离子对SF2的酶活力有显著的促进作用,底物降解测得其酶活力为139mU/mg。底物降解模式分析表明,SF2只能去除不饱和二糖ΔHexUA（2S）β1-3GalNAc（6S）的2-O-硫酸根,但不作用于其它位置的硫酸根,属于CS/DS 2-O-硫酸酯酶,在CS/DS寡糖硫酸化模式编辑和功能研究中具有重要应用价值。