论文部分内容阅读
淀粉酶是最早实现工业应用并且是迄今为止用量最大的商品化酶制剂,约占全球酶制剂市场份额的30%。碱性α-淀粉酶是一类在碱性条件下具有最高催化活力和稳定性的淀粉酶,被广泛应用于纺织退浆和洗涤添加剂等工业领域中。然而目前商品化应用的碱性α-淀粉酶在工业生产环境中普遍存在酶活低、热稳定性差和碱不稳定等不足,极大地限制了它们的应用范围,亟需研究者从自然界中挖掘新的碱性α-淀粉酶基因扩充基因资源数据库,并通过各种分子改造策略对野生型淀粉酶进行改造,使其满足工业生产应用的要求。本研究从新酶基因的挖掘出发,克隆得到一种新的碱性α-淀粉酶,并对其进行酶学性质分析。通过同源建模得到该α-淀粉酶的三维空间结构,在此基础上,对其进行结构域改造,使该酶的热稳定性、催化效率及表达量等大幅提高。具体研究内容及实验结果如下:1.新酶基因的挖掘:通过Horikoshi培养基从土壤样品中筛选到一株高产碱性α-淀粉酶的菌株,通过16S rDNA序列同源性比对,发现该菌与兼性嗜碱菌Bacillus pseudofirmusOF4 的 16S rDNA 序列一致性为 100%,将该菌命名为Bacilluspseudofirmus 703。通过PCR克隆得到碱性Α-淀粉酶基因Amy703,通过氨基酸序列分析表明该酶具有Α-淀粉酶的7个保守区域,对其进行聚类分析发现该Α-淀粉酶属于糖苷水解酶13家族(GH13)中的新亚类,属于一个新的α-淀粉酶。2.酶学性质分析:将Amy703在大肠杆菌中异源表达,纯化后,对其进行酶学性质分析。结果显示Amy703的最适反应条件为40℃和pH 9.0,其在40 ℃以下的稳定性较好,在35℃处理20min后,残余酶活在95%以上,同时,该酶具有很好的碱稳定性,在4℃下于pH 8.0-10.5范围内处理12 h后残余酶活高于80%。Ca2+和Mg2+能极大促进该酶的酶活,当反应体系中含有10 mM Ca2+和Mg2+时,相对酶活分别提高了 2倍和2.48倍,EDTA几乎使该酶完全失活,说明该酶为金属酶。该酶的最适反应底物为可溶性淀粉,Km值为3.92mg/ml,Vmax为17.664 nmol/min/mg,该酶对支链淀粉也具有较大的水解活性,并能水解直链淀粉和糖原。此外,通过定点突变技术验证了该酶的催化三联体结构。3.结构模拟和分子改造。基于合成酶学中的活性部位与蛋白质骨架原理,只要维持活性部位的构象,蛋白质的骨架部分可以增、减和替换。由于目前存在的大部分蛋白质均属于模块化蛋白质,即蛋白质结构由二个或二个以上具有相对独立的结构域和执行特定功能的结构域构成,我们推测通过结构域的改造,包括删除、融合和替换,使蛋白质的整体骨架发生变化,从而可能获得催化效率、稳定性等多种酶学性质改变的突变体酶。利用MOE软件对Amy703进行结构模拟分析,结果显示该酶由四个结构域组成,N端结构域在已酶学性质表征的淀粉酶中均不存在,是Amy703特有的结构域。作为上述推测的验证,我们分别及组合缺失了 Amy703的N端和C端结构域(DomainC),得到3个Amy703突变体,即N端结构域缺失的N-Amy703、C端结构域缺失的C-Amy703和两端结构域缺失的(N+C)-Amy703。由于已有研究证实第二个结构域(DomainB)与TIM barrel之间的相互作用在维持Α-淀粉酶的结构稳定性与催化活性方面具有重要作用,因此本研究没有对其进行缺失突变分析。4.突变体的酶学性质分析。将上述三个突变体分别在大肠杆菌中诱导、纯化后,测定突变体的比酶活,发现N端结构域缺失突变体N-Amy703的比酶活(U/mg)为170.2,是Amy703的40倍,而C-Amy703与(N+C)-Amy703的比酶活均比Amy703低,因此选择N-Amy703做进一步酶学性质分析。结果表明N-Amy703的最适反应温度为50 ℃,比 Amy703 提高了 10℃,最适 pH 从 Amy703 的 pH 9.0 提高到 pH 9.5。N-Amy703 的热稳定性也有较大改善,在50℃的半衰期是Amy703的3-4倍。N-Amy703对可溶性淀粉的 为 11.88 mg/ml,最大反应速率Vm 为 659.2 μmol/min/mg,Kcat 为 50182 min-1,Kcat/Km 为 4224.1 L/(g·min)。而 Amy703 的 Vmax 为 17.7nmol/min/mg,Kcat 为 1943 min-1,Kcat/Km为495.7L/(g·min)。由此可知,N-Amy703的催化常数(Kcat)是野生型酶Amy703的25.8倍,N-Amy703的催化效率(Kcat/Km)是Amy703的8.52倍。N端结构域氨基酸序列比对发现N端结构域含有一个保守的蛋白结构域家族E_set,这个家族的部分成员最近被确定为CBM 48(Carbohydrate Binding Module 48)家族。底物结合实验表明N-Amy703失去与直链淀粉的结合能力,说明N端结构域与不可溶性底物的结合有关,初步确定N端结构域为CBM。