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目的观察甲基化酶抑制剂5-氮杂胞苷对人急性早幼粒白血病细胞株HL60细胞增殖抑制作用及对其细胞凋亡与周期进展的影响,检测HL60细胞周期调节蛋白基因P16、死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因及甲基化转移酶修复基因(MGMT)甲基化状态及5-氮杂胞苷对这些基因甲基化的逆转作用;并运用比较蛋白质组学方法分析5-氮杂胞苷作用HL60细胞前后表达差异的蛋白质分子,探讨其作用机制。策略与方法1.观察5-氮杂胞苷对HL60细胞增殖抑制作用及探讨是否通过凋亡促进机制实现:采用常规细胞培养方法,用不同浓度的5-氮杂胞苷作用于HL60细胞,通过MTT实验观察5-氮杂胞苷对HL60细胞的抑制率,计算IC50;采用流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞周期分布特点。2. 5-氮杂胞苷逆转基因甲基化研究:采用甲基化特异性PCR法(methylation specific PCR,MSP)检测5-氮杂胞苷作用前后HL60细胞P16基因、DAPK基因及MGMT基因的甲基化状态,探讨HL60细胞系基因甲基化状态及5-氮杂胞苷对甲基化基因的逆转作用,采用RT-PCR技术检测5-氮杂胞苷作用前后HL60细胞P16基因、DAPK基因及MGMT基因的表达情况;从而进一步探讨5-氮杂胞苷的作用机理及证明基因甲基化在白血病发生、发展中的作用。3.比较蛋白质组学方法分析5-氮杂胞苷对HL60的可能作用机制:通过双向电泳技术对5-氮杂胞苷处理前后HL60细胞总蛋白进行分离,用PDquest(8.0)软件对扫描的二维凝胶电泳图像进行分析,筛选出5-氮杂胞苷处理HL60细胞前后差异表达的蛋白质斑点。对候选差异表达蛋白质斑点经胶内胰酶酶解,经基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析,得到肽指纹图谱(peptide moss fingerprinting,PMF),使用Mascot软件在Swissprot数据库中检索鉴定差异表达蛋白质,并对差异蛋白质进行生物信息学分析。结果1.在HL60细胞中加入不同浓度的5-氮杂胞苷,培养24、48、72小时后发现:各浓度5-氮杂胞苷均可以不同程度的抑制细胞生长,且表现为时间、浓度依赖性。同一浓度的5-氮杂胞苷作用于HL60细胞,随着时间的延长,其抑制效应增加;在同一时间点,随着浓度的增加,5-氮杂胞苷的增殖抑制效应逐渐增强。根据抑制率结果计算出作用24、48、72小时的IC50为56.76μmol/L、5.22μmol/L、1.78μmol/L。5-氮杂胞苷使HL60细胞发生凋亡,经相对低剂量浓度药物处理48小时后,随着5-氮杂胞苷浓度的增加,凋亡细胞百分比逐渐增多。经5-氮杂胞苷处理后,G1期细胞逐渐增多,S期细胞减少,G2/M期细胞相对增多,细胞阻滞在G1/S期,且随着药物浓度的增加,这种阻滞趋势更明显。2.在急性早幼粒细胞白血病细胞株HL60细胞中,甲基化特异性PCR(MSP)显示P16基因、DAPK基因及MGMT基因甲基化引物扩增出阳性条带,而非甲基化引物未能扩增出条带,提示P16、DAPK基因及MGMT基因启动子区CpG岛均表现为高甲基化。应用Azacytidine处理后P16及DAPK基因甲基化引物未见扩增产物,而非甲基化引物则扩增出阳性产物,提示P16及DAPK基因启动子区CpG岛在用药后发生了去甲基化。MGMT基因在应用Azacytidine处理后甲基化引物及非甲基化引物均扩增出阳性产物,提示MGMT基因启动子区CpG岛在用药后发生了部分去甲基化。HL60细胞基因启动子区CpG于用药前呈高甲基化状态,其mRNA表达水平低,经5-氮杂胞苷处理后,P16、MGMT、DAPK基因表达水平较用药前均明显上调。3.通过对5-氮杂胞苷处理前后的二维凝胶电泳图像进行对比分析,发现28个蛋白斑点表达有差异,对差异蛋白斑点进行酶切并经MALDI-TOF-MS分析后,鉴定出了11种可能的差异蛋白,嘌呤核苷磷酸化酶、锌指蛋白57、Wnt信号诱导蛋白1及过氧化氢酶升高;4个Ras相关蛋白家族成员、RNA解旋酶、DNA复制准许因子-微小染色体维持蛋白(MCM)、锌指蛋白569经药物处理后表达降低。所鉴定的这些差异蛋白主要涉及基因表达调控及信号转导途径,提示5-氮杂胞苷在基因水平的调控效应及对信号转导的影响。结论1.5-氮杂胞苷对早幼粒白血病细胞株HL60具有增殖抑制作用,其24、48、72小时的IC50分别是56.76μmol/L,5.22μmol/L,1.78μmol/L。2.5-氮杂胞苷对HL60细胞具有促进凋亡作用,使细胞周期阻滞在G1/S期,且具有浓度依赖性。3.HL60细胞P16、DAPK及MGMT基因均具有启动子区高甲基化特点,经5-氮杂胞苷处理后,P16及DAPK基因发生了完全去甲基化,而MGMT基因发生了部分去甲基化效应。4.5-氮杂胞苷不仅作用于HL60甲基化位点,比较蛋白质组学鉴定出11种差异表达蛋白,生物信息学分析发现这些蛋白主要是基因表达调控及信号转导相关蛋白。