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目的借助生物信息学手段对let-7a的靶基因进行预测和分析,以期获得更多的有关let-7a参与的转录后调控机制的信息。方法利用miRGen数据库,以hsa-let-7a基因为检索词,选择miRanda,PicTar及TargetScanS三种计算机方法预测结果的交集,对let-7a靶基因进行预测,并通过该数据库提供的GO(Gene Ontology)注释信息对靶基因的生物学功能进行分析,筛选保守程度高、结合自由能低并且与肿瘤细胞增殖密切相关的基因作为候选靶基因。结果经生物信息学预测,我们得到了82个let-7a靶向作用的蛋白编码基因,并筛选出8个与肿瘤增殖相关的基因作为候选靶基因,包括:NRAS、CDC34、TUSC2、NIRF、GAS7、DUSP1、RB1及PDGFB。基于NIRF(Np95/ICBP90-like RING finger)在肿瘤细胞增殖活动中的重要作用,我们着重对候选靶基因NIRF进行了分析。NIRF基因定位于9p23-24.1,全长共802个氨基酸残基,含有NIRF_N、PHD、SRA及RING四个结构域;NIRF 3′UTR(untranslation region)含有一个let-7a的结合位点,其与let-7a 5′端的第1-9位碱基序列完全互补,let-7a与NIRF靶基因二聚体结构的自由能为-16.89kcal/mol,而且该NIRF 3′UTR结合位点在四个物种(包括人、小鼠、大鼠、犬)的基因组中高度保守。结论let-7a涉及的调控范围非常广泛,NIRF很可能是let-7a的一个靶基因。目的通过实验方法验证NIRF基因是否是let-7a的直接作用靶基因。方法构建含有NIRF 3′UTR全长的荧光素酶报告质粒pRL-TK- NIRF 3′UTR;将pRL-TK或pRL-TK-NIRF 3′UTR与pGL3-control,及let-7a mimics或control mimics共转染A549细胞(let-7a表达很低),双荧光素酶报告系统检测转染后A549细胞中荧光素酶的表达;将pRL-TK或pRL-TK- NIRF 3′UTR与pGL3-control,及let-7a inhibitor或control inhibitor共转染HeLa细胞(表达内源性的let-7a),双荧光素酶报告系统检测转染后HeLa细胞中荧光素酶的表达;分别以let-7a mimics或control mimics转染A549细胞,let-7a inhibitor或control inhibitor转染HeLa细胞,Western blot检测NIRF蛋白表达的变化。结果经测序证实荧光素酶报告质粒pRL-TK-NIRF 3′UTR构建成功;共转染let-7a mimics,pRL-TK-NIRF 3′UTR与pGL3-control的A549细胞组,荧光素酶活性明显降低(P<0.01),为对照组(共转染pRL-TK与pGL3-control的A549细胞组)的49.29%;共转染let-7a inhibitor,pRL-TK-NIRF 3′UTR与pGL3-control的HeLa细胞组,荧光素酶活性显著增强(P<0.01),比对照组(共转染pRL-TK与pGL3-control的HeLa细胞组)增加了46.77%;Western blot检测显示,与未转染的A549细胞相比,转染let-7a mimics的A549细胞中NIRF蛋白的表达显著降低(P<0.01),而转染control mimics的A549细胞中NIRF表达无明显变化(P>0.05);与未转染的HeLa细胞相比,转染let-7a inhibitor的HeLa细胞中NIRF蛋白的表达显著增加(P<0.01),而转染control inhibitor的HeLa细胞中NIRF表达无明显变化(P>0.05)。结论NIRF 3′UTR含有let-7a的调控信息,let-7a负性调控NIRF基因的表达,NIRF是let-7a的一个靶基因。目的研究let-7a对A549细胞增殖的影响并探索其分子机制。方法构建let-7a真核表达质粒pGenesil-let-7a,同时设计并构建一个阴性对照质粒pGenesil-control;构建针对NIRF基因的特异性siRNA表达质粒si-1、si-2、si-3及对照质粒si-nc;将pGenesil-let-7a及pGenesil-control转染肺癌A549细胞,G418筛选,并经Real-time RT-PCR检测let-7a的表达进行验证,从而建立稳定表达pGenesil-let-7a及pGenesil-control的A549细胞株,分别命名为A549-let-7a及A549-control细胞;采用MTT法比较A549、A549-control及A549-let-7a细胞的增殖能力并绘制生长曲线;流式细胞术分析各组细胞的细胞周期;Western blot及免疫细胞荧光检测各组细胞中NIRF、p21WAF1及p27kip1蛋白的表达水平;NIRF基因的siRNA表达质粒si-1、si-2、si-3及si-nc分别转染A549细胞,Western blot检测NIRF及p21WAF1蛋白表达的变化;pIRES2-EGFP-NIRF及pIRES2-EGFP质粒分别转染A549-let-7a细胞,Western blot检测NIRF及p21WAF1蛋白的表达水平。结果经测序证实,重组质粒pGenesil-let-7a及pGenesil-control构建成功,NIRF基因的siRNA表达质粒si-1、si-2、si-3及si-nc构建成功;Real-time RT-PCR结果证实,与A549细胞相比,A549-let-7a细胞中let-7a的表达水平显著增加(P<0.01),为A549细胞中表达量的5.34倍,而A549-control中let-7a的表达无明显变化(P>0.05),表明成功获得稳定表达细胞株,即A549-let-7a及A549-control细胞;MTT结果显示A549-let-7a细胞较A549细胞增殖能力明显降低;流式细胞分析结果表明A549-let-7a细胞生长停滞于G1期;Western blot显示,与A549细胞相比,A549-let-7a细胞中NIRF的表达明显减少(P<0.01),p21WAF1蛋白的表达明显增加(P<0.01),p27kip1蛋白的表达无明显变化(P>0.05);免疫细胞荧光亦发现,与A549细胞相比,A549-let-7a细胞中NIRF的表达明显减少(P<0.01),p21WAF1蛋白的表达明显增加(P<0.01);Western blot分析A549细胞中NIRF基因的RNAi效果显示,si-1、si-2及si-3均能显著地抑制NIRF基因的表达(P<0.01),其抑制率分别为70.27%,42.85%及65.49%,而各组相应的p21WAF1蛋白表达显著增加(P<0.01),与未处理的A549细胞相比,分别增加了64.21%,25.73%及34.54%;Western blot结果表明,与未处理的A549-let-7a细胞相比,转染pIRES2-EGFP-NIRF的A549-let-7a细胞中NIRF表达显著增加(P<0.01),p21WAF1表达显著降低(P<0.01)。结论let-7a对A549细胞的生长的抑制作用至少部分是通过靶向调控NIRF,上调p21WAF1蛋白的表达水平实现的。目的研究let-7a对A549细胞裸鼠移植瘤生长的影响及其可能的分子机制。方法将A549、A549-control及A549-let-7a细胞分别接种至裸鼠背部皮下,观察移植瘤的生长情况并计算抑瘤率,30天后处死裸鼠,取出瘤体并称重;Real-time RT-PCR检测各组肿块中let-7a的表达水平;HE染色观察瘤组织的形态学改变;Western blot及免疫组织化学检测各组肿块中NIRF及p21WAF1蛋白的表达差异。结果与A549细胞注射组相比,A549-let-7a细胞注射组裸鼠的瘤组织质量显著降低(P<0.01),抑瘤率为27.51%,A549-control细胞注射组无显著差异(P>0.05);Real-time RT-PCR结果显示A549-let-7a细胞注射组瘤组织中let-7a的表达水平较A549细胞注射组显著增加(P<0.01),为A549细胞注射组的4.25倍,而A549-control细胞注射组let-7a的表达水平无明显变化(P>0.05);HE染色显示A549-let-7a细胞注射组,癌细胞较其它两组体积减小,核浆比例明显缩小,核分裂相显著减少;Western blot及免疫组织化学结果均表明,与A549细胞注射组相比,A549-let-7a细胞注射组瘤组织标本中NIRF的表达明显减少(P<0.01),p21WAF1蛋白的表达明显增加(P<0.01);而A549及A549-control细胞注射组中NIRF和p21WAF1蛋白的表达无显著性差异(P>0.05)。结论let-7a能显著抑制A549细胞在体内的生长能力,其机制可能与let-7a靶向调控NIRF引起的p21WAF1蛋白表达的上调有关。