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茶尺蠖(Ectropis oblique,Eo),是茶园中发生最普遍,危害最严重的食叶害虫之一。主要分布于广东、广西,四川、江、浙一带茶区。由于目前茶尺蠖防治方法主要为化学药物喷洒,因而其体内某些基因可能在杀虫剂代谢时起作用。本研究通过对溴氰菊酯处理后的茶尺蠖转录组分析中筛选出四个表达量升高的基因——谷胱甘肽硫转移酶EoGST534和EoGST968,UDP-糖基转移酶Eo UGT438和Eo UGT678,在大肠杆菌BL21中表达了EoGST534,EoGST968,Eo UGT438及Eo UGT678,测定了融合蛋白EoGST534,EoGST968最适温度,最适p H及酶活。使用q RT-PCR技术检测了四种基因在毒死蜱,甲氰菊酯及溴氰菊酯刺激后基因的变化量,应用RNAi技术分别干扰EoGST534,EoGST968,Eo UGT438及Eo UGT678,检测四种基因的变化规律,初步探讨其在茶尺蠖杀虫剂代谢中的作用。1.解毒相关基因的生物信息学分析利用生物信息学软件及网站分析四种蛋白的理化性质,EoGST534分子量为24.669 kDa,理论等电点为5.42,N端含由21个氨基酸组成的信号肽,包含两个保守结构域——N端结构域和C端结构域;EoGST968分子量为24.274 kDa,理论等电点为5.44,无信号肽,包含两个保守结构域——N端结构域和C端结构域;二者都与与苹果小卷蛾GST1同源性最高。Eo UGT438分子量为59.369 kDa,理论等电点为8.19,N端含由20个氨基酸组成的信号肽,包含一个糖基转移酶结构域;Eo UGT678分子量为57.635 kDa,理论等电点为9.17,N端含由20个氨基酸组成的信号肽,包含一个糖基转移酶结构域。2.解毒相关基因的原核表达及酶活测定重组EoGST534大小约为40 kDa,最适温度为50℃,最适p H为10,在最适条件时酶活为7.32 U/mg;重组EoGST968大小约为40 kDa,最适温度为50℃,最适p H为9.5,在最适条件时酶活为1.064 U/mg。重组Eo UGT438大小约为68 kDa,重组Eo UGT678大小约为69 kDa。使用p ET-32a载体在大肠杆菌BL21(DE3)中表达两种蛋白均为包涵体形式。3.q RT-PCR检测基因表达规律茶尺蠖2,3,4龄幼虫受到溴氰菊酯刺激后,12 h内EoGST534,EoGST968表达量明显降低,Eo UGT438及Eo UGT678表达量显著升高,而在24 h时EoGST534,EoGST968表达量显著升高,而Eo UGT438及Eo UGT678表达量逐渐降低。说明GSTs及UGTs在茶尺蠖溴氰菊酯代谢进程中可能起到不同作用,在茶尺蠖幼虫被毒死蜱及甲氰菊酯处理24 h后,四种基因表达量有不同程度的增加,说明4种基因在毒死蜱及甲氰菊酯代谢过程中也起到一定作用。4.RNAi化学方法体外合成EoGST534,EoGST968,Eo UGT438及Eo UGT678的ds RNA电泳条带单一且浓度较高,浓度分别为570.2 ng/μL、352.3 ng/μL、681.0ng/μL、696.4 ng/μL,868.2 ng/μL。四种ds RNA注射茶尺蠖4龄幼虫后与EGFP ds RNA相比,EoGST534 ds RNA,EoGST968 ds RNA抑制效果在90%以上,而Eo UGT438 ds RNA抑制效果在70%左右,Eo UGT678 ds RNA抑制效果为80%左右。ds RNA注射后使用毒死蜱,甲氰菊酯,溴氰菊酯刺激幼虫,检测发现四种基因表达量与注射EGFP ds RNA的对照组相比,表达量有不同程度降低,表明四种ds RNA对EoGST534,EoGST968,Eo UGT438及Eo UGT678的表达仍有一定抑制作用。在RNAi后重新测定毒死蜱、甲氰菊酯、溴氰菊酯对茶尺蠖四龄幼虫的毒力,发现EoGST534 ds RNA处理组对甲氰菊酯和溴氰菊酯的敏感性增强,EoGST968 ds RNA处理组对毒死蜱及溴氰菊酯敏感性增强,Eo UGT438 ds RNA处理组无变化,Eo UGT678 ds RNA处理组对毒死蜱及溴氰菊酯的敏感性增强,进一步证明EoGST534,EoGST968及Eo UGT678在茶尺蠖杀虫剂代谢中有一定作用。