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禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）是一种宿主为禽类的具有传染性的反转录病毒,临床上主要引起禽类发生良性或恶性肿瘤、免疫抑制、产蛋率下降、体重减轻和死亡等。鸡禽白血病病毒主要有A、B、C、D、E、J和K共7个亚群,其中ALV-K是近几年新发现的一个亚群。目前分离到的ALV-K毒株可分为外源性LTR ALV-K和内源性LTR ALV-K。外源性LTR ALV-K分离自芦花鸡肿瘤病例样本,而内源性LTR ALV-K分离株在不同国家均有报道,其复制能力弱,还没有致肿瘤病例的报道。此外,本课题组对SPF鸡肝脏样品进行的转录组学数据分析表明,内源性LTR ALV-K感染可引起ERK/MAPK信号通路富集,而ERK/MAPK信号通路与肿瘤的密切相关。因此,本研究拟探析内源性LTR ALV-K感染过程中ERK/MAPK信号通路激活的作用。为明确内源性LTR ALV-K的感染和致病性,对一株分离自健康种鸡群的内源性LTR ALV-K GD1601株进行研究。103 TCID50/0.2 mL ALV-K GD1601和ALV-J CHN06株体外感染DF-1细胞试验发现,第1、3、5和7 DPI（Day Post Infection）时,GD1601病毒滴度均显著低于CHN06（P<0.05）;103 TCID50/0.2 mL ALV-K GD1601腹腔接种1日龄SPF鸡,49 DPI时,SPF鸡泄殖腔排毒阳性率达到最高为33.3%（4/12）。第7 DPI和14 DPI时,ALV-K攻毒组仅有同一只鸡（1/15）为DF-1细胞病毒血症阳性。除此以外,试验期内其余鸡均为病毒血症阴性;在第49、63、77和91 DPI对鸡外周血单核细胞提取总RNA进行RT-PCR检测的结果中,阳性率在33.3%77.8%之间,且同居组的3只鸡最多检测到2只鸡为阳性。第91 DPI时,用所建荧光定量PCR对SPF鸡组织脏器的检测中,以肺、肾和腺胃有较高的载毒量,但试验期内ALV-K GD1601株对SPF鸡的增重无显著影响,且感染组无肿瘤病例。为了定量分析ALV-K RNA合成水平,建立了基于SYBR Green I荧光定量PCR检测ALV-K的方法。该方法对禽流感病毒AIV、新城疫病毒NDV、马立克病毒MDV、ALV-A、ALV-B、ALV-E、ALV-J以及DF-1的DNA或cDNA样品均未有效扩增,显示良好的特异性;该方法比普通PCR至少灵敏100倍;该方法的组内重复试验和组间重复试验的变异系数均不超过1.95%。本文对ERK/MAPK信号通路在内源性LTR ALV-K感染中的作用进行了研究。ALV-K在感染DF-1和CEF的早期（15 min）引起ERK蛋白磷酸化,且磷酸化水平具有病毒滴度依赖性,随后磷酸化水平逐渐降低,直至感染后第6 h恢复到正常水平。ALV-K感染同样可诱导试验鸡脾脏细胞ERK蛋白发生磷酸化。进一步在体外和体内对ERK/MAPK信号通路上游和下游原癌基因进行检测发现,ALV-K诱导ERK/MAPK发生磷酸化时其上游原癌基因Ras和下游原癌基因c-Myc表达量均显著上调（P<0.05）。用ERK/MAPK上游蛋白MEK抑制剂PD98059体外抑制ERK/MAPK信号通路后,ALV-K诱导的Ras和c-Myc表达量均显著下调（P<0.05）,且下调过程具有抑制剂浓度依赖性。ALV-K体外感染和体内感染都激活ERK/MAPK信号通路,并且可以引起ERK/MAPK信号通路中的原癌基因Ras和c-Myc上调,且其上调过程是依赖于ERK/MAPK信号通路活化完成的。本文还研究了ERK/MAPK信号通路对ALV-K复制能力的影响。体外水平MEK抑制剂PD98059和U0126抑制ERK/MAPK信号通路后,利用荧光定量PCR和ELISA分别检测ALV-K RNA水平和ALV-K p27蛋白表达水平。结果表明,ALV-K感染DF-1细胞的同时使用50μM的PD98059和U0126处理,ALV-K RNA复制的抑制效果最显著（P<0.001）,且随着抑制剂浓度的提高,其RNA合成水平越来越低。抑制ERK/MAPK信号通路以后,ALV p27蛋白表达水平降低。针对ERK2基因的siRNA干扰试验结果表明ALV-K RNA合成水平及ALV p27蛋白表达量均显著减少（P<0.05）。其结果提示ERK/MAPK信号通路的活化影响ALV-K体外复制。综上所述,内源性LTR ALV-K GD1601株的复制能力、致病（瘤）能力相对较弱,但仍可激活ERK/MAPK信号通路,并且ERK/MAPK信号通路的活化是ALV-K体外复制所必须的,抑制其活化导致ALV-K体外复制能力降低。此外,ERK/MAPK信号通路的活化上调了MAPK通路的上游原癌基因Ras和下游原癌基因c-Myc的表达。