绝经后骨质疏松症患者因为本身雌激素水平的下降,导致全身骨骼系统代谢平衡紊乱,直至骨质疏松,因此绝经后骨质疏松症实质上是一种骨代谢异常引起的代谢类疾病。我国中老年妇女绝经后骨质疏松症的发病率据不完全统计已达到50%,其根本原因是破骨细胞的骨吸收作用和成骨细胞的骨形成作用严重失衡,导致骨量减少和骨显微结构退化变性,使得骨质脆弱,骨折发生率高。绝经后骨质疏松症也是造成颌面部骨质损失的主要危险因素,此种情况一旦发生,不仅可导致牙槽骨的吸收,还可发生更为严重的牙龈萎缩、牙根暴露、基牙附着丧失、基牙脱落甚至颌骨萎缩等一系列不利于临床正畸治疗的棘手问题,给患者带来了痛苦和生活质量的下降,同时也给正畸科临床医生的治疗带来巨大的障碍。当前临床上治疗绝经后骨质疏松症主要采取激素替代疗法,或用钙和其他药物制剂来抑制骨吸收。由于药物制剂本身有副作用,再加上吸收不良,疗效不稳定,患者依从性差等一系列不可控因素,这些方法不能取得令人满意的治疗效果。来源于动物骨髓中的骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMMSCs),具有成体干细胞的自我更新和多向分化潜能,能分化为成骨细胞,促进骨的生长、形成以及骨的修复过程。在绝经后骨质疏松症发生的同时,来源于患者体内的BMMSCs其成骨分化能力在基因水平衍生出了明显的缺陷,有研究表明引起绝经后骨质疏松症患者骨质流失的一个重要因素就是其体内BMMSCs的成骨分化减弱,而成脂分化增强。目前还没有找到确凿可靠的方法从基因水平改善绝经后骨质疏松症患者BMMSCs成骨分化能力减弱的状况。FTY-720 (fingolimod,芬戈莫德)是1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate, SIP)的化学类似物。最初由日本学者从中草药冬虫夏草的有效成分多球壳菌素ISP-1改造而成,作为一种新型的免疫制剂广泛应用于临床。近来研究发现,FTY-720有促进成骨样细胞系向成骨分化的能力。然而,FTY-720能否改善绝经后骨质疏松症患者BMMSCs受损的成骨能力至今未见报道,且FTY-720促进成骨的相关机制也未见有相关研究。Smad信号通路是成骨分化过程中起关键调控作用的信号通路之一。Smads蛋白家族充斥在这个通路各个环节中,而其中的Smad4蛋白处于Smad信号通路中游水平,它在分类上属于通用型转运蛋白,可以与Smads蛋白家族中的受体型Smad1、2、3、5、8耦合辅助其转位至细胞核内,调控下游基因的表达,可见其作用之重要。因此,本课题的目的旨在首先验证FTY-720能否从基因水平改善绝经后骨质疏松动物模型的BMMSCs的成骨分化缺陷,然后通过针对Smad4基因设计siRNA序列构建慢病毒载体,感染骨质疏松动物模型的BMMSCs形成shRNA (Short hairpin RNA,短发夹样RNA)稳转细胞株,抑制细胞内Smad信号通路中Smad4蛋白的表达从而阻断Smad信号通路,再次验证FTY-720能否在基因水平改善绝经后骨质疏松动物模型的BMMSCs的成骨分化能力。初步探寻FTY-720促成骨作用的相关机制。为达此目的,本课题设计了以下研究内容。研究内容：1)建立去势大鼠骨质疏松模型SD大鼠首先分为两组：去势组(OVX)和假手术组(SHAM)-OVX组直接用外科手术方法将雌性SD大鼠双侧卵巢行卵巢切除术(ovariectomy, OVX),此组即是用来建立绝经后骨质疏松症的动物模型组；另一SHAM组则在相同条件下只切除卵巢周围等量的脂肪组织。大约90天过后,分别对两组大鼠进行称重,并用Micro-CT扫描仪对骨密度(BMD)、骨小梁厚度指数(trabecular thickness, Tb.Th)和骨小梁体积分数(bone volume fraction, BVF)进行测量,以鉴定大鼠骨质疏松动物模型是否建立成功。2)不同浓度梯度FTY-720对OVX大鼠BMMSCs成骨分化的影响动物模型一旦确认构建成功,则利用全骨髓贴壁法结合酶消化时间控制的方法来分离纯化rBMMSCs (rat BMMSCs,大鼠骨髓间充质干细胞)。用倒置显微镜来观察细胞形态,应用流式细胞技术来检测细胞表面标记分子的表达,使用MTT法对细胞的增殖能力进行检测,利用成骨、成脂诱导实验检测细胞的多向分化能力。配制1nM、10nM、100 nM三个浓度梯度的FTY-720成骨诱导液,对分别来自OVX组与SHAM组的rBMMSCs连续诱导21天,在7、14、21天时检测细胞成骨相关基因(Runx2、Sp7、OCN、ALP) mRNA的表达水平,在21天时检测这些基因的蛋白表达水平,从而判断细胞的成骨分化状况。3)慢病毒介导的Smad4基因沉默对FTY-720增强rBMMSCs成骨能力的影响根据在基因库里查询到的大鼠Smad4的基因信息,使用Invitrogen在线siRNA序列设计软件,设计合成3条针对目的基因CDS区的siRNA序列以及一条无意义的乱序排列的siRNA-Negative序列作为对照组应用于实验中。然后依照第条siRNA序列的碱基编码,设计出互补的两条DNA模板单链,再按照反应体系合成出相应的DNANA单链。DNA单链退火完成后,与shRNA质粒的表达载体(GV112 Vector)进行连接反应后送至基因公司进行基因测序。将测序结果与设计相一致的shRNA1、shRNA2、shRNA3制备已经编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒载体pGV-LV,重组病毒表达载体构建成功后,即对质粒的DNA进行去内毒素抽提；使用HEK-293T细胞接受shRNA病毒表达载体质粒的转染,而后对病毒转染效率进行观察。采用qRT-PCR和Western blot的方法检测293T细胞的Smad4基因被干扰后,其内源性Smad4基因的mRNA与蛋白质的表达水平以验证干扰是否成功。再根据结果用干扰效率最高的shRNA2病毒转染细胞株继续下一步研究。在293T细胞内包装和生产慢病毒颗粒的步骤完成后,测定病毒滴度。按照梯度稀释法以重组慢病毒颗粒过夜感染去势组大鼠BMMSCs,筛选能够达到有效感染效率(80%以上)的稳转细胞株。qRT-PCR(?)Vestern Blot分别检测去势大鼠BMMSCs稳转细胞株内Smad4基因干扰和蛋白抑制的效率。然后继续用qRT-PCR和Western blot的方法检测10 nM FTY-720诱导下去势大鼠BMMSCs稳转株成骨相关基因与蛋白的表达情况,以评价Smad4基因靶向抑制对FTY-720促rBMMSCs-OVX成骨作用的影响。4)慢病毒介导的Smad4基因沉默对去势大鼠颅骨缺损模型在FTY-720促成骨作用下愈合质量的影响首先用手术方法构建去势大鼠颅骨直径为7mm圆形缺损模型,用明胶海绵分别复合稳转细胞株(shRNA2慢病毒表达载体感染去势大鼠BMMSCs稳定沉默Smad4的转染细胞)和正常的去势大鼠BMMSCs(对照)充填于骨缺损处,5周后行Micro-CT扫描检测颅骨缺损处骨形成情况,以评价FTY-720对去势大鼠的骨修复作用,以及靶向抑制了Smad4基因后此作用的消失。研究结果①术后3个月,两组间大鼠体重、骨密度、骨小梁厚度指数及骨小梁体积分数均具有统计学差异。去势组大鼠体重增加,股骨、胫骨骨密度、骨小梁厚度指数及骨小梁体积分数都降低。②体外采用全骨髓自然贴壁筛选法结合酶消化时间控制方法分离培养的rBMMSCs其形态大部分为长梭形或者多角形,可以长满整个培养皿底,MTT曲线是典型的“S”形,且从第4天开始OVX组BMMSCs的OD值高于SHAM组。细胞表面标志物为间充质标记物CD29,CD44, CD90和血管细胞黏附分子CD106呈现强阳性；造血干细胞标志物CD34和CD45呈阴性。并具有向成骨、成脂方向分化的能力,证明所培养的细胞是rBMMSCs。③构建了1 nM,10 nM,100 nM三个浓度的FTY-720成骨诱导液分别对rBMMSCs-OVX(云势组大鼠的BMMSCs)和rBMMSCs-SHAM(假手术组大鼠的BMMSCs)进行了成骨诱导,这三组培养液均能使细胞的成骨相关基因(Runx2、Sp7、OCN、ALP) mRNA的表达和蛋白表达增高,其中以10nM组的最高,促进成骨能力最强。④对作为表达载体的质粒GV112进行酶切线性化处理后与设计的3条siRNA成功进行了连接及转化,制备出用于感染的4种shRNA质粒表达载体(包括用于对照的Negative组)。⑤对基因重组后的4种慢病毒质粒载体成功进行了慢病毒的包装、感染和纯化,qRT-PCR和Western blot检测结果显示shRNA2的慢病毒表达载体干扰效率最高,所以选用以shRNA2序列为基础的慢病毒颗粒构建rBMMSCs-OVX的稳转细胞株。⑥成功构建了rBMMSCs-OVX+Lenti-shRNA2 (LV-S2-OVX)的稳转细胞株。qRT-PCR和Western blot检测结果显示LV-S2-OVX急转细胞株的Smad4基因mRNA水平与蛋白水平均被明显抑制。⑦与对照组无意义序列shRNA病毒感染细胞株相比(rBMMSCs-OVX+shRNA-Negative),10nM的FTY-720诱导液条件下LV-S2-OVX稳转细胞株的成骨相关基因(Runx2、Sp7、OCN、 ALP) mRNA和蛋白的表达水平被明显抑制。⑧Mcro-CT扫描结果显示无意义链病毒感染细胞株LV-Neg-OVX复合明胶海绵修复骨缺损,术区有较明显新骨形成。而稳转细胞株(LV-S2-OVX)组的术区无新骨形成,骨缺损清晰可见。研究结论1)采用以全骨髓贴壁筛选法为基础,结合酶消化时间的控制来分离培养rBMMSCs-OVX与rBMMSCs-SHAM这两组细胞,其纯化和扩增效果良好；再根据其生物学特性,以流式细胞术检测的表型特征为参考,便能对rBMMSCs进行鉴定。而OVX手术本身不会改变rBMMSCs的表型特征。2) 1 nM,10 nM,100 nM 三个浓度的FTY-720都可以促进rBMMSCs-OVX的体外成骨分化能力,其中以10nM的FTY-720促成骨分化能力最强。3)构建的稳转细胞株CrBMMSCs-OVX+Lenti-shRNA2, LV-S2-OVX)对大鼠BMMSCs的Smad4基因的干扰效率高,稳定性好。4)抑制了Smad信号通路核心因子Smad4基因后,FTY-720的促成骨分化作用明显降低,说明FTY-720的促成骨分化作用是通过Smad信号通路实现的。5)体内实验证实,抑制了Smad4基因,FTY-720不能促进骨形成。