OsMT基因耐受重金属特性的初步研究

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MT(metallothionein,MT)是一类可与重金属结合并富含半胱氨酸的小分子蛋白质或多肽,广泛分布于生物界。近年来对金属硫蛋白的研究日益深入,很多证据表明,金属硫蛋白不仅维持体内必需微量元素的平衡,还具有拮抗电离辐射,清除氧自由基以及重金属解毒等作用,还与机体生长发育、延缓衰老及某些疾病有关。目前,植物金属硫蛋白较之于动物金属硫蛋白由于量小且极易氧化,使得研究相对滞后。本研究以前期实验室通过cDNA文库筛选,且根据生物信息学分析得到的启动子区域都有响应重金属胁迫相关的顺式作用元件的4个水稻金属硫蛋白(OsMT)基因,作为研究对象。利用酵母互补、原子光谱分析、红外光谱分析等方法,对其响应及耐受重金属胁迫的机理进行了初步探究,结果如下:通过基因表达分析发现4个OsMT基因能够受到重金属(Cd、Cu、Zn)胁迫、盐胁迫(NaCl)、渗透胁迫(甘露醇)、氧化胁迫(H2O2和甲基紫精)和植物激素JA的诱导,且主要在水稻根中表达,而在水稻叶片中表达不明显,推测OsMT基因主要是在根中响应逆境胁迫。通过构建PYES260-OsMT载体,并在重金属缺陷型酵母Δzrc1、Δycf1和Δcup2中表达4个Os MT基因,结果显示,4个OsMT基因对3种(Cd、Cu、Zn)金属缺陷型酵母均有互补作用。通过火焰原子光谱法比较酵母体内Cd2+的累积量,发现在0.1 mM Cd2+处理下,转OsMT基因酵母比未转基因酵母的累计量高。分析酵母在重金属胁迫下的生长状况,结果显示转基因酵母能提高突变株的生长状况,说明转OsMT基因能提高酵母对重金属的耐受性。利用PGEX4T-3构建OsMT-GST蛋白表达载体,成功诱导并纯化得到4个重组蛋白。比较转基因菌株在重金属胁迫下的生长状况,结果显示表达4个蛋白的菌株能够提高对重金属耐受能力。通过对GST-OsMT-4c与Cd2+螯合物进行电泳,发现其迁移率变化明显。对GST-OsMT-1-4C与Cd2+螯合物进行紫外光谱分析显示在250 nm处出现波峰,进行红外光谱分析显示在2493 cm-1处波峰变化明显,推测是GST-OsMT-4c与Cd2+螯合是OsMT-1-4c蛋白中的巯基与Cd2+结合实现的。
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