研究背景:骨肉瘤(osteosarcoma)是最常见的骨原发性恶性肿瘤。通过手术和化疗的联合治疗,骨肉瘤患者的5年生存率已经提高至大约70%,然而手术治疗对肢体的功能有严重的影响,化疗在治疗患者的同时也伴随着不同程度的副作用。为了提高骨肉瘤患者的早期诊断和预后水平,亟需找到新的治疗靶点和用于诊断的生物标记物。近年来,识别基因特异性甲基化的改变逐渐被应用于癌症的早期检测和治疗。找到与甲基化相关的生物标记物和治疗靶点有助于提高患者的生存率。此外,生物信息学和基因测序的普及为找到新的靶点提供了良好的条件。目前与骨肉瘤相关的异常甲基化靶点仍然未被充分研究。所以,本研究旨在利用生物信息学分析寻找与骨肉瘤有显著相关的更敏感、更特异的异常甲基化靶点和生物标记物以提高骨肉瘤患者的早期诊断和预后。目的:本研究旨在通过综合生物信息学分析鉴定与骨肉瘤发病机制相关的异常甲基化差异表达的生物标记物。方法:第一部分:从GEO数据库获取4个基因表达谱芯片,其中包括miRNA表达谱数据(GSE28423、GSE65071),mRNA 表达谱数据(GSE36001)以及 DNA甲基化芯片(GSE36002)。其中GSE28423数据集包含19个骨肉瘤样本和4个正常样本,GSE65071包含20个骨肉瘤样本和15个正常样本,GSE36001和GSE36002数据集各包含19个骨肉瘤样本和6个正常样本。运用GEO数据库自带分析工具GEO2R对数据集进行分析,并筛选出具有差异甲基化位点的差异表达基因。分析所取差异mRNA、miRNA需满足阈p.value<0.05,log|FC|>1,差异DNA甲基化需满足阈值p.value<0.05,log|β|>0.2。将上述得到的符合条件的差异miRNA进行靶标预测,得到了对应差异miRNA的靶向mRNA。第二部分:将mRNA(GSE36001)的表达矩阵利用GSEA桌面工具进行了 GSEA分析,找了显著富集通路上的mRNA和上述得到的miRNA靶向的差异表达差异甲基化的mRNA进行取交集,后对该部分mRNA构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络,并利用cytoscape软件对STRING数据库构建的PPI网络进行可视化。使用R软件对差异基因进行功能富集(GO)分析和通路富集(KEGG)分析。第三部分:利用R语言针对基因的表达和甲基化程度做相关性分析,同时利用在线数据库R2对差异基因进行生存分析,评估基因的预后。将骨肉瘤细胞MG63分为两组,分别以DMSO和5-氮杂胞嘧啶水合物(5-azacytidine,5-Aza)处理48小时,使用qPCR检测基因的表达水平。第四部分:将骨肉瘤细胞MG63分为两组,分别以DMSO和5-Aza处理48小时,用cck8法检测细胞增殖。通过划痕实验、细胞迁移和细胞侵袭实验检测异常甲基化对细胞的迁移和侵袭能力的影响。结果:第一部分:通过上述数据集的分析,得到相应的差异miRNA、差异表达基因和差异甲基化基因,以及miRNA潜在的靶基因。将所得到的基因列表导入至venn图制作软件中,筛选出187个高甲基化修饰表达下调的基因和3个低甲基化修饰上调的基因。对187个高甲基化修饰下调的基因通过进一步筛选,通过与GSE36001数据集的GSEA分析所富集基因取交集,筛选出47个高甲基化修饰表达下调的富集到显著通路上的基因。第二部分:GO分析提示这些基因可能参与细胞的外部刺激的正向调节,炎症反应的调节和免疫反应的调节等生物过程。KEGG分析提示这些基因可能参与PI3K-AKT通路、JAK-STAT通路。PPI网络提示大部分基因在蛋白水平上具有复杂的相互作用关系。第三部分:基于TSG数据库的联合分析,我们对47个基因进行进一步筛选,得到8个高甲基化修饰表达下调的抑癌基因。生存分析提示其中6个基因的生存分析提示基因表达下调组的病人预后较基因表达上调组差(P<0.05)。相关性分析提示8个基因的高甲基化修饰与基因表达下调呈负相关(P<0.05)。qPCR分析提示其中6个基因经过5-aza处理以后表达升高(P<0.05)。第四部分:与对照组相比,处理组的增殖能力、迁移能力、侵袭能力下降(P<0.05)。结论:包括PYCARD,STAT5A,CDH5,CXCL12和CXCL14在内的抑癌基因在骨肉瘤中异常甲基化,是潜在的预后生物标志物和治疗靶标。我们的发现为甲基化在骨肉瘤进展中的作用提供了新的见解。