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目的:糖尿病肾病(dibetic nepropathy,DN)是糖尿病严重的并发症之一,影响近50%的糖尿病患者,然而导致DN的潜在分子机制仍未完全阐明。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是表观遗传调控的重要组成部分,在DN的发病机制中发挥重要作用。反义lncRNA可以通过调控正义转录物,从而参与疾病的发生发展。ARAP1(ArfGAP with RhoGAP domain,ankyrin repeat and PH domain 1)基因位于2型糖尿病易感位点附近,研究证明其蛋白水平变化与细胞骨架变化,高尔基体重塑及膜受体运输相关。本研究通过高糖培养人肾小管上皮细胞(HK-2),观察lncRNA-ARAP1-AS2(ARAP1 antisense RNA 2)、ARAP1的表达变化。通过敲低ARAP1表达,明确其是否通过调节Cdc42-GTP水平介导高糖诱导的HK-2细胞EMT和纤维化的发生。使用ARAP1-AS2过表达质粒探讨ARAP1-AS2是否通过调控ARAP1参与高糖诱导的HK-2细胞损伤,以期发现DN发生的新分子机制,为糖尿病肾小管损伤的临床治疗提供新策略。方法:1、将HK-2细胞分为正常糖组(NG)和高糖组(HG),培养48小时后,RT-PCR检测lncRNA-ARAP1-AS2,ARAP1 mRNA水平变化,Western blot及免疫荧光检测ARAP1的表达变化。2、将HK-2细胞分为空质粒正常糖组(NC-NG),空质粒高糖组(NC-HG),ARAP1敲低正常糖组(ARAP1-shRNA-NG),ARAP1敲低高糖组(ARAP1-shRNA-HG),通过活性Cdc42 Pulldown实验检测Cdc42-GTP水平,鬼笔环肽荧光染色观察细胞骨架,Transwell及划痕实验观察细胞迁移,Western blot检测EMT及纤维化指标的变化,明确ARAP1敲低在高糖诱导的HK-2细胞损伤中的作用。3、将HK-2细胞分为空质粒正常糖组(NC-NG),空质粒高糖组(NC-HG),ARAP1-AS2过表达正常糖组(ARAP1-AS2-up-NG),ARAP1-AS2过表达高糖组(ARAP1-AS2-up-HG),RT-PCR及Western blot检测ARAP1-AS2过表达对ARAP1及HK-2细胞间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响。结果:1、RT-PCR,Western blot及免疫荧光结果显示高糖培养HK-2细胞48小时后,ARAP1-AS2,ARAP1表达上调(P<0.05)。2、RT-PCR,Western blot结果显示pLKO.1-shRNA3对ARAP1具有更明显的敲低作用(P<0.05)。3、活性Cdc42 Pulldown实验显示高糖状态下,HK-2细胞中Cdc42-GTP水平增加,敲低ARAP1可减少Cdc42-GTP水平(P<0.05)。4、鬼笔环肽荧光染色显示高糖导致HK-2细胞的细胞骨架发生重组,细胞伪足形成。减少ARAP1表达,可抑制高糖状态下的细胞骨架重排。5、Transwell及划痕实验显示高糖培养HK-2细胞48小时,细胞迁移增加。敲低ARAP1可以减少高糖诱导的细胞迁移,而敲低ARAP1对正常糖组细胞的迁移无明显影响。6、Western blot结果显示高糖培养HK-2细胞48小时,α-SMA,FN,Collagen IV表达增加,E-cadherin表达减少。敲低ARAP1表达,改善了高糖诱导的α-SMA,E-cadherin及FN,Collagen IV的表达变化(P<0.05)。7、ARAP1-AS2过表达可模拟高糖状态下HK-2细胞的损伤,ARAP1、α-SMA表达增加,E-cadherin表达减少(P<0.05)。结论:1、高糖诱导HK-2细胞ARAP1-AS2,ARAP1表达增加。2、高糖状态下,HK-2细胞Cdc42-GTP水平增加,细胞骨架重排,细胞迁移增加。敲低ARAP1的表达可以通过降低Cdc42-GTP的水平,减少HK-2细胞骨架重排,伪足形成,从而减少细胞迁移,EMT及纤维化的发生。抑制ARAP1的表达可能是治疗糖尿病肾小管损伤的新靶标。3、ARAP1-AS2可能通过正向调控ARAP1的表达参与HK-2细胞EMT变化。