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奶山羊的泌乳性能与乳腺的发育息息相关，哺乳动物在生长发育过程中，其乳腺经历着细胞生长、增殖、分化、凋亡等生命过程。研究发现，miRNAs和circRNAs作为非编码RNA，通过调控基因转录后水平对乳腺的发育及泌乳活动发挥关键作用。本课题组在前期研究中发现，在初乳期和泌乳高峰期的奶山羊乳腺组织中存在着差异表达显著的miR-574-5p，但其具体的调控机制尚未见报道。因此，本试验将miR-574-5p在奶山羊乳腺上皮细胞(GMECs)中过表达，通过转录组测序技术(RNA-Seq)构建RNA文库，利用生物信息学预测其下游靶mRNA及上游circRNA；通过荧光素酶报告载体的构建、RT-qPCR、WesternBlot、CCK-8、EdU、流式细胞术、ELISA等技术，以及通过干扰、过表达以及共表达等方法，从circRNA、miRNA和mRNA三个层面研究miR-574-5p对奶山羊乳腺上皮细胞调控作用的分子机制，主要结果如下：
1.过表达miR-574-5p奶山羊乳腺上皮细胞的转录组测序
通过RNA-Seq技术构建了miR-574-5p在GMECs中过表达的RNA文库，获得了高质量的转录组信息。共筛选出332个在miR-574-5p过表达文库中差异表达的基因，其中有74个上调基因，258个下调基因。通过GO注释和KEGG信号通路分析发现这些差异表达基因参与多种生物学功能。通过RT-qPCR检测随机挑选的10个基因(MAP3K9、DGKI、DGKH、RPS6KA2、SEL1L、ADCY3、EVI5L、SVEP1、STON2、SCARA3)在miR-574-5p过表达组及对照组中的mRNA表达量，其结果与RNA-Seq的测序趋势一致。
2.miR-574-5p对奶山羊乳腺上皮细胞的调控作用
miR-574-5p在奶山羊的心脏、脾、肝、肺、乳腺、卵巢、子宫组织中均有表达，而在乳腺中表达量较高；和初乳期相比，miR-574-5p在泌乳高峰期的乳腺组织中有更高表达量。miR-574-5p抑制GMECs的增殖，促进GMECs的凋亡。miR-574-5p抑制GMECs分泌β-酪蛋白(β-casein)和甘油三酯，且下调泌乳相关基因(CSN2(β-casein)、CSN1S2(as2-casein)、CSN3(kappa-casein)、JAK2、STAT5、mTOR、S6K1、4EBP1、SREBP1、PPARG、FASN和FABP3的mRNA表达。
3.miR-574-5p通过MAP3K9对奶山羊乳腺上皮细胞的调控作用
MAP3K9在奶山羊的心脏、脾、肝、肺、乳腺、卵巢、子宫组织中均有表达，而在乳腺中表达量较高；和初乳期相比，MAP3K9在泌乳高峰期的乳腺组织中有较低表达量。MAP3K9作为下调显著的差异表达基因，miR-574-5p靶向作用于MAP3K9的3’UTR且抑制其表达。miR-574-5p通过靶基因MAP3K9下调JNK-c-Jun-cyclinD1信号通路，抑制GMECs的增殖；负调控ERK-RSK1-Bad和JNK/ERK-Bcl-2-Bax信号通路，促进GMECs的凋亡。miR-574-5p还可以通过靶基因MAP3K9下调PI3K-AKT-mTOR及JNK-mTOR-S6K1/4EBP1信号通路，抑制GMECs分泌β-酪蛋白和甘油三酯。
4.miR-574-5p通过AKT3对奶山羊乳腺上皮细胞的调控作用
AKT3在奶山羊的心脏、脾、肝、肺、乳腺、卵巢、子宫组织中均有表达，而在乳腺中表达量较高；和初乳期相比，AKT3在泌乳高峰期的乳腺组织中有较低表达量。miR-574-5p靶向作用于AKT3的3’UTR且抑制其mRNA与蛋白的表达。miR-574-5p通过靶基因AKT3下调mTOR-S6K1/4EBP1信号通路，抑制GMECs分泌β-酪蛋白和甘油三酯。
5.circ-016910竞争性抑制miR-574-5p对奶山羊乳腺上皮细胞的调控作用
基于课题组前期构建的circRNAs文库，通过生物信息学预测调控miR-574-5p的circRNAs，筛选得到circ-016910。circ-016910靶向作用于miR-574-5p的特异结合位点而抑制其表达，且上调miR-574-5p靶基因MAP3K9及AKT3的mRNA与蛋白水平，显示出“miRNA分子海绵”的功能。circ-016910通过miR-574-5p激活JNK-c-Jun-cyclinD1信号通路，促进GMECs的增殖；正调控ERK-RSK1-Bad和JNK/ERK-Bcl-2-Bax信号通路，抑制GMECs的凋亡。此外，circ-016910通过miR-574-5p激活PI3K-AKT-mTOR及JNK-mTOR-S6K1信号通路，诱导GMECs分泌β-酪蛋白和甘油三酯。
综上所述，本试验通过筛选并研究在初乳期和泌乳高峰期的奶山羊乳腺组织中差异表达显著的miR-574-5p，构建出circRNA-miRNA-mRNA对乳腺上皮细胞的调控网络，揭示奶山羊乳腺发育及泌乳过程的分子调控机制，为深入研究奶山羊泌乳调控机理和提高产奶性能提供新的试验依据。
1.过表达miR-574-5p奶山羊乳腺上皮细胞的转录组测序
通过RNA-Seq技术构建了miR-574-5p在GMECs中过表达的RNA文库，获得了高质量的转录组信息。共筛选出332个在miR-574-5p过表达文库中差异表达的基因，其中有74个上调基因，258个下调基因。通过GO注释和KEGG信号通路分析发现这些差异表达基因参与多种生物学功能。通过RT-qPCR检测随机挑选的10个基因(MAP3K9、DGKI、DGKH、RPS6KA2、SEL1L、ADCY3、EVI5L、SVEP1、STON2、SCARA3)在miR-574-5p过表达组及对照组中的mRNA表达量，其结果与RNA-Seq的测序趋势一致。
2.miR-574-5p对奶山羊乳腺上皮细胞的调控作用
miR-574-5p在奶山羊的心脏、脾、肝、肺、乳腺、卵巢、子宫组织中均有表达，而在乳腺中表达量较高；和初乳期相比，miR-574-5p在泌乳高峰期的乳腺组织中有更高表达量。miR-574-5p抑制GMECs的增殖，促进GMECs的凋亡。miR-574-5p抑制GMECs分泌β-酪蛋白(β-casein)和甘油三酯，且下调泌乳相关基因(CSN2(β-casein)、CSN1S2(as2-casein)、CSN3(kappa-casein)、JAK2、STAT5、mTOR、S6K1、4EBP1、SREBP1、PPARG、FASN和FABP3的mRNA表达。
3.miR-574-5p通过MAP3K9对奶山羊乳腺上皮细胞的调控作用
MAP3K9在奶山羊的心脏、脾、肝、肺、乳腺、卵巢、子宫组织中均有表达，而在乳腺中表达量较高；和初乳期相比，MAP3K9在泌乳高峰期的乳腺组织中有较低表达量。MAP3K9作为下调显著的差异表达基因，miR-574-5p靶向作用于MAP3K9的3’UTR且抑制其表达。miR-574-5p通过靶基因MAP3K9下调JNK-c-Jun-cyclinD1信号通路，抑制GMECs的增殖；负调控ERK-RSK1-Bad和JNK/ERK-Bcl-2-Bax信号通路，促进GMECs的凋亡。miR-574-5p还可以通过靶基因MAP3K9下调PI3K-AKT-mTOR及JNK-mTOR-S6K1/4EBP1信号通路，抑制GMECs分泌β-酪蛋白和甘油三酯。
4.miR-574-5p通过AKT3对奶山羊乳腺上皮细胞的调控作用
AKT3在奶山羊的心脏、脾、肝、肺、乳腺、卵巢、子宫组织中均有表达，而在乳腺中表达量较高；和初乳期相比，AKT3在泌乳高峰期的乳腺组织中有较低表达量。miR-574-5p靶向作用于AKT3的3’UTR且抑制其mRNA与蛋白的表达。miR-574-5p通过靶基因AKT3下调mTOR-S6K1/4EBP1信号通路，抑制GMECs分泌β-酪蛋白和甘油三酯。
5.circ-016910竞争性抑制miR-574-5p对奶山羊乳腺上皮细胞的调控作用
基于课题组前期构建的circRNAs文库，通过生物信息学预测调控miR-574-5p的circRNAs，筛选得到circ-016910。circ-016910靶向作用于miR-574-5p的特异结合位点而抑制其表达，且上调miR-574-5p靶基因MAP3K9及AKT3的mRNA与蛋白水平，显示出“miRNA分子海绵”的功能。circ-016910通过miR-574-5p激活JNK-c-Jun-cyclinD1信号通路，促进GMECs的增殖；正调控ERK-RSK1-Bad和JNK/ERK-Bcl-2-Bax信号通路，抑制GMECs的凋亡。此外，circ-016910通过miR-574-5p激活PI3K-AKT-mTOR及JNK-mTOR-S6K1信号通路，诱导GMECs分泌β-酪蛋白和甘油三酯。
综上所述，本试验通过筛选并研究在初乳期和泌乳高峰期的奶山羊乳腺组织中差异表达显著的miR-574-5p，构建出circRNA-miRNA-mRNA对乳腺上皮细胞的调控网络，揭示奶山羊乳腺发育及泌乳过程的分子调控机制，为深入研究奶山羊泌乳调控机理和提高产奶性能提供新的试验依据。