新生抗原（简称新抗原）仅存在于肿瘤组织而不表达于正常细胞中,具备高特异性、低免疫耐受性、低毒副作用、易合成与多靶点等优势,已成为肿瘤精准化治疗理想策略之一。新生抗原多肽疫苗作为新一代肿瘤个性化治疗方式之一,是当前国内外肿瘤免疫治疗的前沿研究热点。然而,依据国内外临床试验结果显示,新抗原疫苗在激活患者产生抗肿瘤免疫应答的效率仍不高,总体疗效欠佳;而单次注射疫苗仅对患者提供短暂的免疫保护作用,需重复注射以达到预防肿瘤复发或转移的作用效果。但此期间对患者依从性要求较高,并且易产生额外人力与经济成本,给肿瘤患者带来负担。为此,我们制备一种可注射的新抗原凝胶疫苗,经单次注射后可在注射部位形成药物储库,即可为机体提供长效的抗肿瘤免疫保护作用。首先,我们构建Hepa1-6皮下肿瘤模型,对新抗原凝胶疫苗的防御和治疗性能进行评估。随后,发现小鼠接受凝胶疫苗治疗后,其肿瘤组织内CD8+T细胞表面TIM-3受体、肿瘤细胞表面Gal-9配体高表达,而两者结合会抑制T细胞的免疫功能。为此,构建Hepa1-6原位肝癌模型,探究联合使用TIM-3单克隆抗体与新抗原凝胶疫苗的抗肿瘤治疗效果。实验内容:1)首先,选用经生物信息学分析与ELISPOT筛选获得的鼠源肝癌细胞系Hepa1-6特异性新生抗原、TLR9受体激动剂Cp G-ODN与STING受体激动剂c GAMP,与使用蚕茧制备获取的丝蛋白凝胶前体溶液混合,制备新抗原凝胶疫苗NGC-gels。2)对该凝胶疫苗的微观结构,溶胀性能,溶液稳定性及可注射性进行评价;3)在溶液与动物体层面,评估新抗原凝胶疫苗中各组分的释放动力学规律,体内淋巴结富集与抗原呈递情况,探明新抗原凝胶疫苗激活抗原呈递细胞和细胞免疫应答机制;4)构建皮下Hepa1-6肿瘤防御模型,观察经注射凝胶疫苗免疫后的小鼠对Hepa1-6肝癌细胞的抑制情况,分析其肿瘤生长变化规律及其免疫记忆性;5)构建皮下小鼠Hepa1-6肿瘤治疗模型,探究接种凝胶疫苗后对Hepa1-6肿瘤的免疫治疗作用,对肿瘤浸润性T淋巴细胞、细胞因子与调节性T细胞（Tregs）的免疫状态进行分析;6)构建小鼠Hepa1-6-luc原位肝癌模型,探究联合TIM-3单克隆抗体对增强新抗原凝胶疫苗抗肿瘤免疫疗效的作用机制,利用流式分析和转录组测序技术分析联合治疗策略对肿瘤免疫微环境的影响;7)对经联合治疗治愈的小鼠,再次原位接种Hepa1-6-luc细胞,评估其免疫记忆性及对肿瘤细胞再次侵袭机体时发挥的抗肿瘤作用。实验结果:1)制备的NGC-gels新抗原凝胶疫苗具有疏松多孔结构、稳定性高、可注射且可持续释放新抗原、Cp G-ODN和c GAMP达10天以上;2)小鼠接种NGC-gels凝胶疫苗后,抗原能够有效富集于引流淋巴结并上调树突状细胞DC（DCs）表面CD80、CD86、MHC-Ⅰ和Ⅱ类分子表达,促进DCs成熟并提升其抗原呈递能力,并促进CD8+T细胞活化与增殖;3)在Hepa1-6肿瘤防御模型中,对接种凝胶疫苗的小鼠再注射Hepa1-6肿瘤细胞后,其脾脏内分泌出的效应记忆T细胞(TEM)约为PBS处理组的3倍,并显示出良好的肿瘤抑制作用（4/6）;4)在Hepa1-6肿瘤治疗模型中,（2/6）荷瘤小鼠在接种凝胶疫苗后,表现出对肿瘤的完全抑制作用。但对浸润性T细胞检测时,发现经疫苗治疗后的小鼠,其肿瘤内T细胞被激活并迁移至肿瘤组织内,来抑制肿瘤生长。但同时,该免疫治疗压力下会增加CD8+T淋巴细胞表面TIM-3受体与肿瘤细胞上Gal-9配体的结合机率,导致T细胞耗竭从而失去抗肿瘤作用;5)为此,我们联合TIM-3单克隆抗体与凝胶疫苗,并用于原位肝癌的治疗。发现该联合治疗策略能够完全抑制（4/7）小鼠原位肝癌肿瘤生长,显著优于TIM-3单克隆抗体处理组（0/7）与NGC-gels凝胶疫苗处理组（1/7）;该联合治疗策略能够有效促进DCs细胞活化、CD8+T细胞活化;促进细胞因子和炎症细胞因子分泌;促使IFN-γ+/41BB+/CD8+T细胞激活并浸润至肿瘤,显著抑制肿瘤细胞的再次侵袭。实验结论:本论文制备的NGC-gels凝胶疫苗,与临床混合注射剂型相比,经单次注射可显著提高抗原呈递细胞对抗原交叉呈递效率与T细胞免疫应答,提供长达90天的免疫保护作用,抑制Hepa1-6肿瘤生长,显著延长小鼠总生存期。此外,凝胶疫苗联合TIM-3单抗策略,能够有效抑制小鼠原位肝癌生长,抑制肿瘤转移与复发。