乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase, LDH, EC1.1.1.27)又称NAD氧化酶,是生物体内糖酵解过程中一个重要的氧化还原酶,催化丙酮酸到乳酸的可逆转化,广泛存在于动物组织、细菌和植物中。同时也是常用的临床医用诊断用酶。因此,对该酶的研究具有广阔的应用前景。本研究以植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)为研究材料,应用分子生物学技术克隆ldh基因,实现了ldh基因在原核生物大肠杆菌(Escherichia coli)和真核生物毕赤酵母(Pichia pastoris X33)中的诱导表达及组成型表达,并对LDH蛋白的性质、诱导表达条件等进行了研究。研究结果如下:(1)采用PCR技术克隆得到了L. plantarum ldh基因,基因片段大小为963 bp,与GenBank AY513726.1 DNA核苷酸序列一致性为99%,氨基酸序列与GenBank ZP 06196423.1的一致性为100%;(2)构建了原核表达载体pET-ldh,经诱导该基因能够在E.coli BL21(DE3)中进行高效表达,诱导出39 kD的特异性融合蛋白,该蛋白在E. coli中的粗酶液的比活为12.3±0.087 U/mg;(3)优化了LDH在E.coli中的诱导表达条件。最佳诱导表达条件为:当OD600为0.8时添加终浓度为10 mmol/L的乳糖诱导,培养温度为16℃,转速为150 r/min时,可溶性LDH的含量最高;(4)研究了酶的最佳反应温度、最佳pH等性质,确定最佳反应温度为45℃,最佳pH为6.5,此时比酶活为19.3±0.056 U/mg;(5)构建了酵母穿梭质粒pPICZ-ldh,应用氯化锂法成功将此重组质粒转入P. pastoris X33中,通过抗性梯度筛选,得到了具有酶活的转化子,实现了该酶在P. pastoris X33中的胞内诱导表达,LDH酶比活为4.83±0.07 U/mg;(6)构建了酵母穿梭质粒pGAPZ-ldh并转化入P. pastoris X33,实现了LDH在P. pastoris X33中组成型分泌表达。在YPD培养基中培养96 h后,LDH能分泌到发酵液中,测定的LDH酶比活为5.94±0.07 U/mg。