菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)属软体动物门、双壳纲、帘形目、帘蛤科、蛤仔属,在我国南北沿海均有分布,我国传统“四大养殖贝类”之一,其生长速度快,养殖周期短,适应性强(广温、广盐、广分布),市场前景广阔。本研究通过组织切片方法对雌二醇刺激条件下的空白组、实验组进行切片显微观察并统计各组的雌雄比,通过荧光定量PCR技术对蛤仔不同发育时期、短期雌二醇处理下蛤仔及长期雌二醇刺激条件下的空白组、实验组中雌雄及雌雄同体蛤仔的Dmrt基因进行表达分析,并通过测序的方法对空白组及雌二醇刺激的实验组进行转录组分析。研究结果为菲律宾蛤仔的早期性腺发育,性别分化及性别调控机制提供理论依据。1、外源性激素作用下蛤仔性别分化情况分析预实验中10μg/L的雌二醇组在测定各组别的雌二醇含量时,该组的雌雄雌二醇含量较空白组有显著的提高。正式实验中,将蛤仔分别在室内常温10μg/L的雌二醇海水中和普通对照海水中养殖,待两个月性腺发育成熟后,进行蛤仔性腺组织切片观察,结果表明,雌二醇处理的实验组组雌、雄蛤仔分别为85、61个,雌雄比为1.39:1;空白组中雌、雄蛤仔分别为68、73个,雌雄比为0.93:1。同时在实验组中出现3个雌雄同体蛤仔,比例为2%。本研究表明,雌二醇对蛤仔性别分化产生影响,可以诱导部分蛤仔性别分化为雌性。2、雌二醇作用下不同性别蛤仔转录组学分析分别选取在10μg/L的雌二醇海水中和普通对照海水中性腺成熟的雌、雄蛤仔,及10μg/L的雌二醇海水中养殖后的雌雄同体蛤仔进行转录组测序、组装及分析(实验组E为雌二醇刺激两个月,空白组D正常养殖两个月,ET为雌雄同体个体),结果表明,E组与D组相比共有697个差异基因,其中288个上调,409个下调。ET与E组相比共有208个差异基因,其中73个上调,135个下调。本研究为菲律宾蛤仔的性别分化提供相关候选基因,并给蛤仔性别分化机制提供理论依据。从GO功能聚类上来看(ETvE),差异表达基因主要富集在与膜运输、糖脂代谢等的GO term上,而在KEGG通路上(EvD),主要的富集在信号转导、核苷酸代谢、感染性疾病:细菌相关的通路中。在KEGG通路上(ETvE),主要富集在信号转导、神经性疾病和碳水化合物代谢相关的通路中。因此我们推测,雌二醇对蛤仔的交流和物质运输产生一定程度的影响。通过选取性别相关差异基因进行转录组验证发现,一些与雄性性腺相关的差异基因表达量下调。从整体上可以看出,推测激素通过影响蛤仔的跨膜运输能力、信号转导过程及调节性别相关基因来调控性别分化过程。3、蛤仔Dmrt基因特征分析及表达研究Dmrt(double-sex and mab-3 relatated transcription factor)基因家族是一个与配子形成、性腺发育、性别分化相关的基因家族。在蛤仔基因组数据中(未发表),运用BLASTe比对确定了菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum的3个Dmrt基因,运用MEGA、expasy、SMART等分析软件进行基因鉴定确定进化关系,根据系统发生树的聚类对3个Dmrt基因进行命名,分别为Dmrt3-like、Dmrt4-like-1、Dmrt4-like-2。采用实时荧光定量PCR研究这Dmrt基因在蛤仔中的时空表达及其对雌二醇处理的响应。结果表明,3个基因的表达量从担轮幼虫到壳顶幼虫时期呈增长迅速,其中Dmrt4-like-2在蛤仔的不同发育时期均有表达。在正常未进行激素处理的蛤仔体内,Dmrt4-like-1和Dmrt4-like-2在鳃和外套膜中表达量最高,Dmrt3-like在鳃和内脏团中表达量较高,在外套膜和水管中不表达。短时期内,雌二醇处理使得这3个基因在蛤仔性腺中的表达量都发生上调。长时期内,在空白组的雄性性腺中3个基因的表达量皆高于雌性性腺。在实验组中雌雄同体性腺的Dmrt4-like-1和Dmrt4-like-2的表达量高于实验组雌性的表达量而低于实验组雄性的表达量。本研究表明Dmrt基因家族参与性别分化、性腺发育过程。为蛤仔性别决定机制的研究提供参考。