【摘 要】
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耐高温α-淀粉酶是工业上最常用的酶制剂之一,广泛使用于淀粉加工、酿造、酒精以及纺织等工业中。寻求与开发耐受高热的淀粉酶长期以来始终是工业酶研究领域的重点与热点课题。极端嗜热古生菌Pyrococcus furiosus产生的胞外α-淀粉酶（PFA）,具有很高的耐热性,更适宜的最适pH值以及不依赖Ca2+等优点,具有良好的应用前景和商业开发价值。本文主要克隆了PFA基因,在大肠杆菌中以包涵体的形式获得
【机 构】
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中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）
【出 处】
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中国科学院大学(中国科学院上海生命科学研究院)
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耐高温α-淀粉酶是工业上最常用的酶制剂之一,广泛使用于淀粉加工、酿造、酒精以及纺织等工业中。寻求与开发耐受高热的淀粉酶长期以来始终是工业酶研究领域的重点与热点课题。极端嗜热古生菌Pyrococcus furiosus产生的胞外α-淀粉酶（PFA）,具有很高的耐热性,更适宜的最适pH值以及不依赖Ca2+等优点,具有良好的应用前景和商业开发价值。本文主要克隆了PFA基因,在大肠杆菌中以包涵体的形式获得了大量的表达,并建立了一种新的简便高效的重组PFA纯化方法。通过PCR方法从Pyrococcus furiosus基因组中扩增出PFA基因,克隆至表达载体pT7473,实现了与His-tag的融合表达。采用尿素溶解和Ni-NTA亲和层析柱柱上复性纯化的方法,初步获得了PFA融合蛋白的纯品。由于N端His-tag融合对PFA的耐热性有一定的影响,我们又构建了PFA的表达载体,实现了在E.coli BL21-Codon Plus （DE3）-RIL菌株的大量表达,针对重组PFA包涵体的溶解与复性展开深入研究,根据PFA的特性,建立了一种碱性条件和加热结合的包涵体溶解方法,然后采用一步疏水层析柱纯化即可获得PFA蛋白纯品。本方法获得的活性蛋白量远高于已报道的其他方法,且蛋白的的耐热性质和比活与报道一致。这种新的纯化方法工艺简便、成本更低且易于放大,为未来工业化生产的建立与应用提供了有益的参考与借鉴.
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