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GPC3与各种肿瘤关系密切,包括肝癌、恶性黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌等,在不同的肿瘤中发挥不同的作用,甚至可能起完全相反的作用。特别是在肝癌中,GPC3在肝癌中可能发挥重要的生物学功能。利用基因转染技术将目的基因转染到特定的细胞,观察目的基因的表达及对细胞生物学特性的影响,是目前应用最广,技术最成熟的基因研究方法。本研究应用载体构建技术构建了带有增强型绿色荧光蛋白标记的GPC3真核表达载体,利用基因转染技术和体外肿瘤侵袭迁移实验,从蛋白和基因水平探讨GPC3对肝癌细胞生物学性质的影响,并观察了GPC3对两种生长因子FGF2、IGF2细胞增殖效应的影响。一、GPC3绿色荧光蛋白真核表达载体的构建根据GenBank中查找的GPC3开放读码框(1740bp),自行设计引物,应用PCR法克隆目的基因GPC3片断,PCR产物与pEGFP-N2质粒分别经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切、胶回收、连接,转化并挑取克隆送测序,结果成功构建了带增强型绿色荧光蛋白标记的重组质粒pEGFP-N2-GPC3。二、GPC3在SK-Hep-1肝癌细胞中的表达及GPC3对其生物学性质的影响在成功构建GPC3基因绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-N2-GPC3系统的基础上,采用脂质体转染技术介导重组GPC3基因在SK-Hep-1细胞中表达,G418(600μg/ml)筛选获得稳定转染细胞,获得的细胞命名为GPC3-SK-Hep-1,并设空质粒对照组pEGFP-SK-Hep-1及空白对照SK-Hep-1,荧光显微镜下观察蛋白的表达情况,RT-PCR检测GPC3mRNA水平的表达。在确定GPC3基因已经成功转染到SK-Hep-1细胞中后,光境下观察基因转染组、空质粒对照组、空白对照组三组细胞的形态学特征,结果各组细胞形态无明显差异;MTT比色法检测转基因对SK-Hep-1细胞增殖的影响,基因转染组与对照组之间,差异有统计学意义(P<0.001),空质粒对照组与空白对照组之间,差异无统计学意义(P>0.05),GPC3抑制SK-Hep-1的增殖;黏附实验,基因转染组、空质粒对照组细胞与Matrigel胶的黏附率分别为(10.21±0.62)%、(15.13±0.83)%,基因转染组细胞黏附率明显下降(P<0.001),抑制率为32.52%;迁移实验,200倍目镜下基因转染组细胞的穿膜细胞数为131.7±7.44。空质粒对照组细胞的穿膜细胞数为71.6±4.76,侵袭实验,200倍目镜下基因转染组细胞的穿膜细胞数为220±12.8。空质粒对照组细胞的穿膜细胞数为138±10.5。两组细胞相比较,迁移、侵袭能力均显著增强(P<0.001);采用MTT法研究GPC3对生长因子FGF2、IGF2细胞增殖效应的影响,GPC3显著抑制FGF2介导的细胞增殖效应(P<0.05),而IGF2介导的细胞增殖效应未见改变(P>0.05),推测GPC3在FGF2信号通路中发挥负性调节因子的作用。