马铃薯Y病毒的HC-pro蛋白是一个抑制能力很强的RNA干扰抑制子。为研究HC-pro蛋白抑制RNA干扰的分子机制,我们试图利用马铃薯Y病毒的HC-pro为诱饵蛋白,通过酵母双杂交从烟草cDNA文库中筛选出与RNA干扰有关的蛋白因子。利用Clontech公司的酵母双杂交试剂盒,在宿主菌AH109中,通过酵母菌的自我重组把烟草叶片的cDNA文库构建在cDNA文库载体pGADT7-Rec上;把HC-pro的cDNA连接到载体pGBKT7上构建成诱饵载体,然后转化到酵母菌Y187中。把含有cDNA文库的酵母菌AH109与含有诱饵载体的酵母菌Y187进行交配,把交配后的菌液直接涂布到SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp四缺培养基上进行筛选。通过两轮四缺培养基筛选和α-X-半乳糖苷酶活性检测,共有136个克隆显示α-X-半乳糖苷酶活性。在这136个克隆中,共测出120个cDNA的序列,编码21个蛋白因子。将这21个cDNA质粒与诱饵质粒pGBKT7-HC-pro一起共转化到酵母菌AH109中,在四缺培养基上作进一步的筛选和α-X-半乳糖苷酶活性检测,有20个cDNA质粒表现互作阳性,分别命名为SZ1—SZ20。通过核苷酸和氨基酸序列比较,发现除了2个未知功能蛋白外,其余的互作阳性因子大致可分为4类:一类是参与植物光合作用和碳水化合物代谢的蛋白,如:参与叶绿体分裂的ParA家族的ATPase、参与三羧酸循环的转酮醇酶、参与TCA循环乌头酸酶、多糖磷酸化酶和果糖激酶;第二类是一些与植物抗逆有关的因子,有山梨醇脱氢酶、真菌及伤口诱导蛋白BARWIN、过氧化氢酶catalose以及半胱氨酸蛋白酶等;第三类是参与基因转录、翻译和蛋白代谢的蛋白因子,有多锌指结构蛋白、20S Proteasome beta亚基、DNA聚合酶家族蛋白等;第四类是有关氨基酸和氮代谢的酶,有天冬氨酸蛋白酶、谷氨酰胺合成酶、胺氧化酶、丝氨酸/苏氨酸脱氢酶等。挑选互作阳性相对较强的SZ1和SZ2 cDNA质粒作为重点研究。 通过5’RACE得到了SZ1的5’端,并通过RT-PCR扩增出了SZ1的cDNA全长。SZ1是一个多锌指结构蛋白,含有8个CCHC锌指结构,N端是连续的RS序列,在第7和第8个锌指结构之间有一个RGG框。另外,SZ1还有一个异构体,在近N端缺失6个氨基酸(16-21),第7位由半胱氨酸变为甘氨酸,第35位由天冬氨酸变为组氨酸。 利用与SZ2核苷酸序列高度同源的番茄基因的核苷酸序列设计出5’端引物,用SZ2的cDNA设计出3’端引物,通过RT-PCR扩增SZ2 cDNA全长,核苷酸和氨基酸序列比对结果表明:SZ2是20S Proteasome蛋白酶复合体的beta亚基。 将SZ1和SZ2的cDNA分别与HC-pro的cDNA一起连接到免疫共沉淀载体pESC-Leu上,然后转化酵母菌株INVScI,经过D-半乳糖诱导表达后,提取酵母菌总蛋白进行免疫共沉淀。实验结果表明,SZ1和SZ2都能与HC-pro蛋白互作。 把SZ1和SZ2分别连接到原核表达载体pMAL-c2x和pET30a上,构建原核表达载体pMAL-c2x-SZ1和pET30a-SZ2,在大肠杆菌中都能诱导表达,并在非变性条件下纯化得到了可溶性蛋白。 SZ1和SZ2与植物RNA干扰之间的联系正在继续研究。