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肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition proteins,PGRPs)是一类在先天性免疫系统中负责识别细菌细胞壁特有成分肽聚糖(peptidoglycan,PGN)的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)。PGRPs的结构在进化中非常保守,但它们在先天性免疫中的功能却存在着差异。作为最先进化出获得性免疫功能的脊椎动物,鱼类是进行免疫机制进化分析和研究先天性免疫在低等脊椎动物中功能的良好模型。草鱼是我国重要的水产养殖鱼类,对草鱼免疫相关分子的研究不论在理论上还是应用上都具有重要意义。本论文对草鱼pgrp基因进行了初步的研究,具体分为以下几个部分:
采用RACE-PCR的方法扩增到草鱼pgrp基因全长cDNA1575bp,其开放阅读框为1395bp,编码长度为464个氨基酸的蛋白。预测的草鱼PGRP的氨基酸序列与其它物种的PGRPs有很高的相似度(尤其是斑马鱼PGRP6),C端具有与噬菌体T7溶解酵素同源的三个保守的PGRP结构域。
用基因组PCR和染色体步移的方法发现了草鱼pgrp基因在基因组上的两个拷贝,并获得了它们各自的基因组DNA全长和上游序列。序列分析表明,草鱼两个pgrp基因拷贝可能具有相同的4个外显子和3个不同的内含子,且具有不相同的上游调控序列。
用RT-PCR技术检测了草鱼pgrp的转录表达情况。分析结果显示,在草鱼肝脏、脾脏和肠道中可以检测到pgrp的表达,而在鳃、头肾、心脏、脑、皮肤和肌肉组织中均检测不到pgrp表达。柱状黄杆菌刺激24h后pgrp的表达分布并没有发尘显著的变化。在草鱼的卵子和早期胚胎和刚孵出的鱼苗中均检测不到pgrp基因的表达。
采用RT-PCR从草鱼肝脏组织cDNA中扩增出pgrp基因的开放阅读框序列,并将其克隆到pGEX-KG载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中对重组质粒pGEX-PGRP进行了诱导表达。经SDS-PAGE及Western blot鉴定,证明成功表达出了PGRP-GST融合蛋白。通过GST亲和层析,得到了较纯的目的蛋白。