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牦牛（Bos grunniens）是我国珍贵的畜种资源,牦牛骨中含有丰富的胶原蛋白（约占21.5%）,补充胶原蛋白肽可以增加骨胶原纤维网架的规则性和牢固性。深入开展对牦牛骨精深加工技术的研究探讨,充分利用牦牛骨中丰富的骨胶原蛋白开发功能性食品,对提高牦牛附加值、增加藏区牧民收益、促进牧区社会经济发展和稳固边疆具有重要意义。本研究以牦牛骨为研究对象,利用酸溶酶提技术制备得到较高纯度牦牛骨胶原蛋白,并对其结构进行了鉴定。基于靶向酶解技术考查了复合蛋白酶（Protamex）、风味蛋白酶（Flavourzyme）、胰蛋白酶（Trypsin）、中性蛋白酶（Neutrase）、碱性蛋白酶（Alcalase）、木瓜蛋白酶（Papain）等6种常用商业蛋白酶对牦牛骨胶原蛋白酶解效果差异,并以水解度、促成骨细胞增殖活性为指标优选了最适用酶;采用响应面法优化了中性蛋白酶酶解牦牛骨胶原蛋白制备促成骨细胞增殖活性肽的最佳工艺参数。利用超滤、体积排阻色谱、反向液相色谱串联质谱技术对牦牛骨胶原蛋白肽进行了进一步分离、纯化和鉴定。通过模拟胃肠道消化、Caco-2细胞单层膜转运模型考查了牦牛骨胶原蛋白肽的消化、吸收、转运机制。基于Real-time qPCR、Western blot和分子对接技术探究了牦牛骨胶原蛋白肽促成骨细胞增殖潜在作用机制。利用骨转换生化标志物、骨生物力学指标、骨形态力学指标考查了牦牛骨胶原蛋白肽抗骨质疏松活性效应;首次基于非靶向代谢组学技术系统探究了牦牛骨胶原蛋白肽抗骨质疏松活性作用机制。取得主要研究成果如下:（1）通过比较分析6种蛋白酶酶解牦牛骨胶原蛋白水解液促成骨细胞增殖率差异,筛选出中性蛋白酶为酶解牦牛骨胶原蛋白制备促成骨细胞增殖活性肽最适用酶,并优化得到最佳酶解工艺组合为:酶解液温度54℃、酶解时间3.6 h、酶底比（E/S）5637 U/g、初始pH 6.12。（2）利用超滤、体积排阻色谱、反向高效液相色谱等方法对酶解牦牛骨胶原蛋白制备得到的促成骨细胞增殖活性肽进行了分离纯化。其中,经超滤后收集得到的组分UF-IV（Mw<3 kDa）表现出较高的促成骨细胞增殖活性;经SuperdexTM peptide 10/300 GL色谱柱（体积排阻色谱法）分离后,组分SP-III表现出较高的促成骨细胞增殖活性,在0.5 mg/mL作用浓度下,促成骨细胞增殖率高达160.6%;经RP-HPLC分离纯化,组分SP-III经Innoval C18色谱柱进一步分离后的组分F8表现出较强的促成骨细胞增殖活性（190.6%）。利用反向液相色谱串联质谱法联合Mascot2.4 search engine对其氨基酸序列进行测定,共鉴定得到35条肽段。基于相对丰度、分子量、比对标准得分等指标筛选出9条具有较高潜在促成骨细胞增殖活性肽进行化学合成验证其体外生物活性,结果表明,GPAGPPGPIGNV（GP-12）肽相较其他8条肽段具有更高的促成骨细胞增殖活性（142.7%）。（3）模拟胃肠道消化试验结果表明,GP-12肽对胃-肠道消化具有一定的抗性,虽部分GP-12肽经肠道内肽酶水解为GPAGPPGPIGN（GP-11）和GPAGPPGPI（GP-9）,经消化后仍可发挥促成骨细胞增殖活性。构建的Caco-2细胞单层膜试验结果表明,GP-12肽会被上皮细胞膜肽酶进一步水解为GPPGPIGNV（GV-9）、AGPPGPIGNV（AV-11）肽,仍有部分GP-12肽可以完整通过Caco-2细胞单层膜而转运,但吸收率较低,其吸收机制为细胞旁路途径吸收。（4）牦牛骨胶原蛋白肽GP-12通过激活Wnt/β-catenin信号通路和EGFR信号通路之间交互作用从而诱导成骨细胞的增殖和分化。体外模拟分子对接结果显示,GP-12肽和表皮生长因子受体EGFR的氨基酸残基结合位点为Asn12、Lys13、Leu14、Thr15、Gln16、Leu17、Gly18、Tyr45、Leu325和Phe357,结合力主要为氢键作用和范德华力。牦牛骨胶原蛋白肽GP-12潜在促成骨细胞增殖作用机制可能为:GP-12肽首先将表皮生长因子受体EGFR激活,活化后的EGFR进一步将GSK-3β因子磷酸化,从而阻止β-catenin蛋白降解,造成β-catenin蛋白在成骨细胞内的积累,从而激活Wnt/β-catenin信号通路诱导成骨细胞增殖过程。（5）牦牛骨胶原蛋白肽（<3kDa）具有较好的促成骨增殖活性,且呈现良好的剂量-效应关系。所提取的牦牛骨胶原蛋白肽（<3kDa）中分子量在1 kDa以下的多肽所占比例高达96.8%。牦牛骨胶原蛋白肽（<3kDa）的促成骨细胞增殖活性可能归因于GPSGPAGKDGRIGQPG（GP-16）、GDRGETGPAGPAGPIGPV（GD-18）或者含有类似氨基酸序列的多肽与表皮生长因子受体EGFR相互作用。（6）牦牛骨胶原蛋白肽（<3kDa）可显著提高机体骨形成相关转换生化标志物（BGP、BALP）的表达和降低机体骨吸收相关生化标志物（TRACP、S-CTX、DPD）表达。大鼠股骨骨生物力学指标方面,相较模型组,牦牛骨胶原蛋白肽（<3kDa）和雌二醇处理组大鼠骨弹性载荷和断裂载荷均呈显著上升趋势（P>0.05）。此外,牦牛骨胶原蛋白肽（<3kDa）和雌二醇可显著提高大鼠骨小梁数目（Tb.N）、骨小梁密度（Tb.BMD）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨体积分数（BV/TV）,降低骨小梁间距（Tb.Sp）的作用（P<0.05）。综上,牦牛骨胶原蛋白肽（<3kDa）能够明显改善去卵巢大鼠骨质疏松症状,且呈现一定的剂量-效应作用关系。（7）共筛选出8种脂类和类脂分子（牛磺酸、花生四烯酸、1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、（4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z）-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、1-硬脂酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、牛磺酸脱氧胆酸、Taurochenodeoxycholate、牛磺胆）,2种有机酸及其衍生物（D-erythro-鞘氨醇-1-磷酸、L-瓜氨酸）,以及1种神经递质类物质（血清素）等11种代谢物为潜在生物标志物。去卵巢大鼠骨质疏松发病机制与机体磷脂代谢、氨基酸代谢和脂肪酸代谢紊乱密切相关。牦牛骨胶原蛋白肽干预去卵巢大鼠骨质疏松过程与Membrane transport（ABC transports）、消化系统（Protein digestion and absorption、Mineral absorption）、翻译（Aminoacyl-tRNA biosynthesis）、氨基酸代谢（Arginine and proline metabolism、Valine,leucine and isoleucine degradation）和脂质代谢（Bile secretion、Primary bile acid biosynthesis、Taurine and hypo taurine metabolism）密切相关,且与细胞免疫、神经系统、碳代谢及内分泌系统等多种代谢通路交互作用,多信号通路、多环节、多靶点和多维度干预大鼠骨质疏松症预防、改善与治疗。