目的：类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis, RA）是一种慢性全身性自身免疫性疾病，其病因及发病机制尚不明确，基本特征为滑膜炎及进行性骨和软骨破坏，阻止破坏是RA治疗的关键。近年来以肿瘤坏死因子-α（TNF-α）抑制剂为代表的生物制剂是RA治疗学的重大突破，但其有效性有限，临床缓解率尚不理想，同时价格昂贵以及可能出现的不良反应，使其在临床应用中受到了限制。近几年研究提示天然植物药有效成分对RA骨破坏可能有治疗作用。本课题拟通过①建立小鼠疼痛模型，筛选三七总皂苷(Panax Notoginseng Saponins，PNS)镇痛的最优剂量；②1%角叉菜胶建立小鼠急性炎症模型，筛选PNS抗炎的最优剂量；③建立大鼠胶原诱导关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型，采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测血清骨保护素（osteoprotegerin，OPG）、细胞核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)以及基质金属蛋白酶-3（Matrix matallprotein-3，MMP-3）的含量，蛋白芯片技术检测血清肿瘤坏死因子-a(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6（Interleukin-6，IL-6)的含量，免疫组织化学法检测CIA大鼠踝关节滑膜组织OPG、RANKL及骨组织MMP-3的表达，探讨RA骨破坏的部分机制及雷公藤多苷联合三七总皂苷对实验性关节炎炎症评分及骨破坏的干预作用，为RA的临床治疗提供实验依据。方法：1小鼠疼痛模型的建立与分组痛阈检测1.1热板法将体重18-22g昆明小鼠置于恒温(55±0.5℃)水浴热板上，观察和记录小鼠自放置热板至舔后足的时间，以此作为痛反应潜伏期。选择痛反应潜伏期10-30S的雌性小鼠40只，随机分为三七总皂苷低、中、高组（50mg·kg-1、100mg·kg-1、200mg·kg-1）、艾瑞昔布组（10mg·kg-1）及生理盐水5组，每组8只，灌胃给药(0.3ml/只)。分别于给药后0.5h、1.0h、2.0h、3.0h测量小鼠痛阈值变化。1.2辐射热刺激法（甩尾法）将体重18-22g昆明小鼠装入笼中，置于鼠尾光照测痛仪上，光束直射于鼠尾1／3处（尾尖上部约1-2cm，记号笔标记，以便每次光照在同一位置），测量小鼠甩尾所需的时间，以此作为痛反应潜伏期。选择痛反应潜伏期为2-6S的雄性小鼠40只，随机分为三七总皂苷低、中、高组（50mg·kg-1、100mg·kg-1、200mg·kg-1）、艾瑞昔布组（10mg·kg-1）及生理盐水组，每组8只，灌胃给药(0.3ml/只)。分别于给药后0.5h、1.0h、2.0h测量小鼠甩尾所需的时间。1.3醋酸扭体法将体重18-22g昆明小鼠40只，均为雌鼠，随机分为三七总皂苷低、中、高组（50mg·kg-1、100mg·kg-1、200mg·kg-1）、艾瑞昔布组（10mg·kg-1）及生理盐水组，每组8只，连续灌胃给药3d，第3天给药后1h，按0.1mg／kg腹腔注射0.7％醋酸溶液，观察5分钟后，开始记录此后15分钟内小鼠的扭体次数(以腹部收缩、躯体扭曲、后肢伸展、蠕行等为判断标准)，并计算抑制率。抑制率=(阴性对照组平均扭体次数一给药组平均扭体次数)／阴性对照组平均扭体次数×100％。2角叉菜胶急性关节炎模型的建立与炎症评估将体重18-22g昆明小鼠40只，雌雄各半，随机分为三七总皂苷低、中、高组（50mg·kg-1、100mg·kg-1、200mg·kg-1）、艾瑞昔布组（10mg·kg-1）及生理盐水组，每组8只，连续灌胃给药3d，第3天给药后1h，各鼠右足趾皮内注射l％角叉菜胶(30ul/只)致炎，分别测量致炎后1h、2h、3h、4h、5h时右后足爪容积，计算各组的肿胀度和肿胀抑制率。肿胀度=致炎后右后足爪容积-致炎前右后足爪容积，肿胀抑制率(％)=（对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度）／对照组平均肿胀度×100％。3胶原诱导关节炎（CIA）大鼠模型的建立与实验室指标检测选择体重150-180g的Wistar大鼠，雌雄各半。测量体重及足趾容积测量仪测量双侧足爪容积后，于大鼠尾根部、右后足跖及背部等多处皮内注射鸡II型胶原0.2ml/只，第14d加强免疫，另取6只用同样的方法注入等量生理盐水为正常对照组。造模后第21d将成模大鼠随机分为模型组、来氟米特组（LEF）、雷公藤多苷组（TG）、TG+三七总皂苷（PNS）组，每组6只，并测量大鼠体重及足爪容积。各治疗组分别给予LEF（10mg·kg-1）、TG(10mg·kg-1)、TG(10mg·kg-1)+PNS(200mg·kg-1)灌胃(3ml/只)，正常对照组和模型组分别给予等量生理盐水，共6周。灌胃结束后第2天测量大鼠体重、足爪容积及AI评分。随即10%水合氯醛腹腔麻醉，腹主动脉取血留取血清，采用ELISA法检测血清OPG、RANKL、MMP-3含量及蛋白芯片技术检测血清TNF-α、IL-6的含量。截取双侧踝关节，固定、脱钙、脱水、浸蜡、包埋及切片，HE染色置于显微镜下观察组织形态学改变，免疫组化法检测踝关节滑膜组织OPG、RANKL及骨组织MMP-3的表达。统计学分析：所有数据均采用SPSS13.0软件包进行统计学分析，所得结果以均数±标准差（x±s）表示。三组间比较采用单因素方差分析（one-wayANOVA），组间两两比较采用LSD法。P＜0.05认为差异有统计学意义。结果：1三七总皂苷对小鼠痛阈的影响1.1热板法给药前各组痛阈无统计学差异（P＞0.05）；给药0.5h：PNS中、高剂量组及艾瑞昔布组痛阈均高于生理盐水组（P＜0.01），PNS低剂量组痛阈高于生理盐水组（P＜0.05），PNS各剂量组痛阈均低于艾瑞昔布组（P＜0.01），PNS低剂量组痛阈低于高剂量组（P＜0.01），PNS中剂量组痛阈低于高剂量组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；给药1h：PNS各剂量组及艾瑞昔布组痛阈均高于生理盐水组（P＜0.01），PNS各剂量组痛阈低于艾瑞昔布组（P＜0.01），PNS低剂量组痛阈低于高剂量组（P＜0.01），PNS中剂量组痛阈低于高剂量组（P＜0.05）；给药2h：PNS各剂量组及艾瑞昔布组痛阈高于生理盐水组（P＜0.01），PNS各剂量组痛阈低于艾瑞昔布组（P＜0.01），PNS低、中剂量组痛阈均低于高剂量组（P＜0.01）；给药3h：PNS各剂量组及艾瑞昔布组痛阈高于生理盐水组（P＜0.01），PNS各剂量组痛阈低于艾瑞昔布组（P＜0.01），PNS低、中剂量组痛阈均低于高剂量组（P＜0.01）。1.2辐射热刺激法（甩尾法）给药前各组痛阈无统计学差异（P＞0.05）；给药0.5h：PNS各剂量组及艾瑞昔布组痛阈均高于生理盐水组（P＜0.01），PNS各剂量组痛阈均低于艾瑞昔布组（P＜0.01），PNS低、中剂量组痛阈均低于高剂量组（P＜0.05）；给药1h：PNS各剂量组及艾瑞昔布组痛阈均高于生理盐水组（P＜0.01），PNS各剂量组痛阈均低于艾瑞昔布组（P＜0.01），PNS低、中剂量组痛阈均低于高剂量组（P＜0.01）；给药2h：PNS各剂量组及艾瑞昔布组痛阈均高于生理盐水组（P＜0.01），PNS各剂量组痛阈低于艾瑞昔布组（P＜0.01），PNS低剂量组痛阈低于高剂量组（P＜0.01），PNS中剂量组痛阈低于高剂量组（P＜0.05）。1.3扭体法PNS中、高剂量组及艾瑞昔布组扭体起始时间均高于生理盐水组（P＜0.01），PNS低剂量组扭体起始时间高于生理盐水组（P＜0.05），PNS各剂量组扭体起始时间均低于艾瑞昔布组（P＜0.01），PNS低、中剂量组扭体起始时间均低于高剂量组（P＜0.05）；PNS中、高剂量组及艾瑞昔布组扭体频率均低于生理盐水组（P＜0.01），PNS低剂量组扭体频率低于生理盐水组（P＜0.05），PNS各剂量组扭体频率均高于艾瑞昔布组（P＜0.01），PNS低、中剂量组扭体频率高于高剂量组（P＜0.05），PNS低、中、高剂量组抑制率分别为12.22%、21.75%、26.71%。2三七总皂苷对角叉菜胶所致小鼠足肿胀的抑制作用致炎1h：PNS中、高剂量组及艾瑞昔布组肿胀度低于生理盐水组（P＜0.01），PNS低剂量组肿胀度低于生理盐水组（P＜0.05），PNS低、中剂量组肿胀度高于艾瑞昔布组（P＜0.01），PNS高剂量组肿胀度高于艾瑞昔布组，但差异无统计学意义（P＞0.05），PNS低剂量组肿胀度高于高剂量组（P＜0.01），PNS中剂量组肿胀度高于高剂量组（P＜0.05），PNS低、中、高剂量组抑制率分别为25%、60%、77.1%；致炎2h：PNS中、高剂量组及艾瑞昔布组肿胀度低于生理盐水组（P＜0.01），PNS低剂量组肿胀度低于生理盐水组，但差异无统计学意义（P＞0.05），PNS低、中剂量组肿胀度高于艾瑞昔布组（P＜0.01），PNS高剂量组肿胀度高于艾瑞昔布组（P＜0.05），PNS低剂量组肿胀度高于高剂量组（P＜0.01），PNS中剂量组肿胀度高于高剂量组，但差异无统计学意义（P＞0.05），PNS低、中、高剂量组抑制率分别为0.21%、40.3%、57.6%；致炎3h：PNS中、高剂量组及艾瑞昔布组肿胀度低于生理盐水组（P＜0.01），PNS低剂量组肿胀度低于生理盐水组，但差异无统计学意义（P＞0.05），PNS低、中剂量组肿胀度高于艾瑞昔布组（P＜0.01），PNS高剂量组肿胀度高于艾瑞昔布组（P＜0.05），PNS低剂量组肿胀度高于高剂量组（P＜0.01），PNS中剂量组肿胀度高于高剂量组（P＜0.05），PNS低、中、高剂量组抑制率分别为0.63%、34.7%、54.5%；致炎4h：PNS中、高剂量组及艾瑞昔布组肿胀度低于生理盐水组（P＜0.01），PNS低剂量组肿胀度低于生理盐水组，但差异无统计学意义（P＞0.05），PNS低、中剂量组肿胀度高于艾瑞昔布组（P＜0.01），PNS高剂量组肿胀度高于艾瑞昔布组，但差异无统计学意义（P＞0.05），PNS低剂量组肿胀度高于高剂量组（P＜0.01），PNS中剂量组肿胀度高于高剂量组，但差异无统计学意义（P＞0.05），PNS低、中、高剂量组抑制率分别为20.0%、52.5%、60.3%；致炎5h：PNS中、高剂量组及艾瑞昔布组肿胀度低于生理盐水组（P＜0.01），PNS低剂量组肿胀度低于生理盐水组（P＜0.05），PNS低、中剂量组肿胀度高于艾瑞昔布组（P＜0.01），PNS高剂量组肿胀度高于艾瑞昔布组，但差异无统计学意义（P＞0.05），PNS低剂量组肿胀度高于高剂量组（P＜0.01），PNS中剂量组肿胀度高于高剂量组（P＞0.05），PNS低、中、高剂量组抑制率分别为32.7%、73.4%、88.2%。3TG、PNS及其配伍对大鼠体重变化的影响造模前各组体重无统计学差异（P＞0.05）。给药前，模型组（12.69±1.16）、TG组（11.80±1.58）、LEF组（12.02±1.76）、TG+PNS组（12.32±1.73）体重增加值均低于正常对照组（24.42±3.09）（P＜0.01）；模型组、LEF组、TG组、TG+PNS组各组间体重增加值无统计学差异（P＞0.05）；给药6周， TG组（11.30±1.53）体重增加值高于模型组（10.54±1.91），但无统计学差异（P＞0.05），LEF组（15.22±2.44）体重增加值高于模型组（P＜0.05），TG+PNS组（16.95±4.40）体重增加值高于模型组（P＜0.01）；TG组体重增加值低于LEF组（P＜0.05），TG+PNS组体重增加值高于LEF组，但差异无统计学意义（P＞0.05），TG+PNS组体重增加值高于TG组（P＜0.01）。4TG、PNS及其配伍对大鼠关节炎指数（AI）变化的影响给药前，模型组（11.50±1.87）、TG组（11.65±1.05）、LEF组（11.17±0.98）、TG+PNS组（10.97±1.75）组间差异无统计学意义（P＞0.05）；给药结束后，TG组（6.33±1.21）、LEF组（5.83±0.75）、TG+PNS组（5.66±1.37）AI评分均低于模型组（11.67±1.03）（P＜0.01），但各用药组组间无统计学差异（P＞0.05）。5TG、PNS及其配伍对大鼠足爪肿胀抑制率变化的影响给药4周，LEF组（83.92±8.35，73.48±9.53）、TG组（87.02±21.63，79.62±14.15）、TG+PNS组（75.28±14.77，74.91±11.94）双侧足爪肿胀率均低于模型组（120.16±11.41，108.65±9.21）（P＜0.01）；各用药组组间无统计学差异（P＞0.05）；LEF组、TG组、TG+PNS组双足平均肿胀抑制率分别为31.26％、27.15%、34.20％；给药6周，LEF组（64.15±3.48，61.34±8.34）、TG组（70.16±10.99，64.73±8.15）、TG+PNS组（56.65±6.34，53.11±2.99）双侧足爪肿胀率均低于模型组（120.24±16.73，109.74±16.57）（P＜0.01）；TG组双足爪肿胀率高于LEF组，但差异无统计学意义（P＞0.05），TG+PNS组双足爪肿胀率低于LEF组（P＞0.05），TG+PNS组双侧足爪肿胀率低于TG组（P＜0.05），LEF组、TG组、TG+PNS组双足平均肿胀抑制率分别为45.38％、41.33%、52.24％。6TG、PNS及其配伍对大鼠血清OPG、RANKL、MMP-3、TNF-α及IL-6水平的影响6.1各组血清OPG（pg/ml）水平的比较模型组（2685.87±169.74）、TG组（2371.38±150.74）、LEF组（2071.35±114.98）OPG水平均高于正常对照组（1611.39±105.82）（P＜0.01），TG+PNS组（1853.16±128.89）OPG水平高于正常对照组（P＜0.05）；LEF组、TG组、TG+PNS组OPG水平均低于模型组（P＜0.01）；TG组OPG水平高于LEF组（P＜0.01），TG+PNS组OPG水平低于LEF组（P＜0.05），TG+PNS组OPG水平低于TG组（P＜0.01）。6.2各组血清RANKL（pg/ml）水平的比较模型组（30.97±1.78）、TG组（26.76±1.33）RANKL水平高于正常对照组（20.01±1.91）（P＜0.01），LEF组（24.55±1.16）、TG+PNS组（22.32±1.18）RANKL水平高于正常对照组（P＜0.05）；LEF组、TG+PNS组RANKL水平低于模型组（P＜0.01），TG组RANKL水平低于模型组（P＜0.05）；TG组RANKL水平高于LEF组（P＜0.05），TG+PNS组RANKL水平低于LEF组，但差异无统计学意义（P＞0.05），TG+PNS组RANKL水平低于TG组（P＜0.05）。6.3各组血清OPG/RANKL比值水平的比较模型组（96.12±7.39）O/R值高于正常对照组（77.52±4.50）（P＜0.01），TG组（91.44±2.47）、LEF组（88.31±8.73）O/R值高于正常对照组（P＜0.05），TG+PNS组（79.68±8.42）O/R值高于正常对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；TG组O/R值低于模型组，但差异无统计学意义（P＞0.05），LEF组、TG+PNS组O/R值低于模型组（P＜0.01）；TG组O/R值高于LEF组，但差异无统计学意义（P＞0.05），TG+PNS组O/R值低于LEF组，但无统计学差异（P＞0.05），TG+PNS组O/R值低于TG组（P＜0.05）。6.4各组血清MMP-3（ng/ml）水平的比较模型组（21.46±1.71）、TG组（18.78±1.15）、LEF组（16.36±0.93）MMP-3水平均高于正常对照组（12.75±1.10）（P＜0.01），TG+PNS组（14.72±0.59）MMP-3水平高于正常对照组（P＜0.05）；LEF组、TG组、TG+PNS组MMP-3水平均低于模型组（P＜0.01）；TG组MMP-3水平高于LEF组（P＜0.01），TG+PNS组MMP-3水平低于LEF组（P＜0.05），TG+PNS组MMP-3水平低于TG组（P＜0.01）。6.5各组血清TNF-α（pg/ml）水平的比较模型组（166.99±3.44）、TG组（153.69±5.35）、LEF组（144.60±4.08）、TG+PNS组（136.18±3.13）TNF-α水平均高于正常对照组（126.24±4.00）（P＜0.01）；LEF组、TG组、TG+PNS组TNF-α水平均低于模型组（P＜0.01）；TG组TNF-α水平高于LEF组（P＜0.01），TG+PNS组TNF-α水平低于LEF组（P＜0.01），TG+PNS组TNF-α水平低于TG组（P＜0.01）。6.6各组血清IL-6（pg/ml）水平的比较模型组（104.90±5.38）、TG组（92.18±4.86）、LEF组（83.95±5.78）IL-6水平均高于正常对照组（66.96±4.74）（P＜0.01），TG+PNS组（74.07±4.88）IL-6水平高于正常对照组（P＜0.05）；LEF组、TG组、TG+PNS组IL-6水平均低于模型组（P＜0.01），TG组IL-6水平高于LEF组（P＜0.05），TG+PNS组IL-6水平低于LEF组（P＜0.01），TG+PNS组IL-6水平低于TG组（P＜0.01）。7TG、PNS及其配伍对大鼠踝关节病理变化的影响病理结果提示，正常组：关节组织未见形态学改变。模型组：炎性细胞浸润，滑膜增生，形成绒毛状突起，突向关节腔或浸入至软骨或软骨下骨质，出现骨侵蚀，甚至出现多核巨细胞侵蚀骨质。各治疗组病理改变较模型组减轻，滑膜增生及骨侵蚀不明显。LEF组（1.50±0.55）、TG+PNS组（1.33±0.52）病理积分低于模型组（2.33±0.51），差异有统计学意义（P＜0.01），TG组（1.83±0.41）低于模型组，但差异无统计学意义（P＞0.05），其中TG+PNS组病理积分最低，但与TG组差异无统计学意义（P＞0.05）。8TG、PNS及其配伍对大鼠踝关节滑膜组织OPG、RANKL及骨组织MMP-3表达的影响8.1各组踝关节滑膜组织OPG表达的比较模型组（64.50±3.08）、TG组（75.00±3.63）、LEF组（84.17±3.19）、TG+PNS组（93.83±4.83）OPG灰度值均低于正常对照组（102.00±2.61）（P＜0.01）；LEF组、TG组、TG+PNS组OPG灰度值均高于模型组（P＜0.01）；TG组OPG灰度值低于LEF组（P＜0.01），TG+PNS组OPG灰度值高于LEF组（P＜0.01），TG+PNS组OPG灰度值高于TG组（P＜0.01），TG+PNS组OPG表达水平最低。8.2各组踝关节滑膜组织RANKL表达的比较模型组（70.00±3.35）、TG组（76.00±4.20）、LEF组（85.83±3.50）、TG+PNS组（94.50±4.23）RANKL灰度值低于正常对照组（104.5±4.59）（P＜0.01）；TG组RANKL灰度值高于模型组（P＜0.05），LEF组、TG+PNS组高于模型组（P＜0.01）；TG组RANKL灰度值低于LEF组（P＜0.01），TG+PNS组RANKL灰度值高于LEF组（P＜0.01），TG+PNS组RANKL灰度值高于TG组（P＜0.01），TG+PNS组RANKL表达水平最低。8.3各组踝关节骨组织MMP-3表达的比较模型组（82.83±4.07）、TG组（92.83±4.62）、LEF组（98.83±5.53）、TG+PNS组（106.00±4.73）MMP-3灰度值低于正常对照组（116.33±5.43）（P＜0.01）；LEF组、TG组、TG+PNS组MMP-3灰度值高于模型组（P＜0.01）；TG组MMP-3灰度值低于LEF组（P＜0.05），TG+PNS组MMP-3灰度值高于LEF组（P＜0.01），TG+PNS组MMP-3灰度值高于TG组（P＜0.01），TG+PNS组MMP-3表达水平最低。结论：1经多种疼痛模型和关节炎模型研究证实，三七总皂苷具有明显的镇痛和抗炎效应，且其药效作用存在量-效关系。2雷公藤多苷对CIA大鼠关节肿胀、关节炎指数和血清炎性细胞因子TNF-a、IL-6具有显著抑制效应；三七总皂苷与雷公藤多苷配伍则显示出在上述抗炎方面的增效作用。3雷公藤多苷配伍三七总皂苷可明显下调CIA大鼠血清和滑膜RANKL、OPG、MMP-3表达，其作用优于单用雷公藤多苷，提示配伍应用在抑制骨破坏方面具有增效效应。