论文部分内容阅读
目的:近年来,越来越多的研究表明,外泌体可由肿瘤细胞分泌到体液中,并与肿瘤的发生发展密切相关。外泌体中含有比较丰富的circRNAs分子,可作为各种疾病诊断和预后的可靠指标。本研究初步建立起结直肠癌血清外泌体circRNAs差异表达谱,对血清外泌体进行提取、鉴定,筛选出用于结直肠癌诊断的circRNAs分子,探究其作为肿瘤标志物的诊断效能,并为阐明circ-PNN在结直肠癌发生发展中的作用机制研究提供思路。方法:本研究前期对结直肠癌患者及健康对照者血清外泌体circRNAs进行测序分析,得到结直肠癌血清外泌体circRNAs表达谱,初步筛选出在多个测序样本中均具有表达的circRNAs分子作为候选分子。应用生信分析软件,对结直肠癌血清外泌体中高表达circRNAs的亲本基因进行Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)分析预测其功能。随后,我们通过沉淀剂法从结直肠癌患者及健康对照者血清中分离并提取外泌体。并通过透射电子显微镜(TEM)、免疫印迹技术(WB)、纳米粒径分析(NTA)技术对所提取外泌体进行鉴定。在得到血清外泌体之后,提取外泌体RNA。针对候选circRNAs分子环化位点设计divergent引物,通过琼脂糖核酸凝胶电泳验证引物的特异性,sanger测序检测circRNAs环化位点,放线菌素D实验证明circRNAs较mRNAs稳定性强。随后,通过逆转录得到cDNA并进一步应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术在训练集(包括88对结直肠癌患者及88对健康对照者)血清外泌体样本中检测候选circRNAs分子的表达情况。同时采用受试者工作特征曲线(ROC)分析血清外泌体中差异表达的circRNAs分子对结直肠癌的诊断效能。训练集样本中表达趋势与测序结果一致的circRNAs分子进入验证阶段。随后,在另一独立样本集,即验证集样本(包括58对结直肠癌患者及58对健康对照)中检测候选circRNAs表达情况,并评估其诊断价值。我们还分析了结直肠癌血清外泌体circRNAs表达水平与临床病理参数的相关性。最后,我们用Targetscan和Miranda等软件预测出和circ-PNN有结合靶点的miRNAs分子及其下游mRNAs,利用Cytoscape绘制出circRNA-miRNAs-mRNAs互作网络图,并通过RT-qPCR验证所预测出的5个miRNAs与circ-PNN在结直肠癌血清外泌体中表达水平之间的关系。结果:我们通过分析结直肠癌患者及健康对照血清外泌体circRNAs测序结果得到circRNAs差异基因表达谱,并对高表达circRNAs进行GO及KEGG分析预测其功能。TEM对所提取外泌体进行形态学鉴定,证实了样本含双层膜结构的球形囊泡;WB技术可检测外泌体表面特异性蛋白CD9和TSG101;NTA证实囊泡粒径大小范围50-150 nm。在训练阶段,我们通过RT-qPCR实验技术分析证实circ-PNN在结直肠癌血清外泌体中高表达。ROC曲线分析circ-PNN对结直肠癌的诊断效能,AUC(曲线下面积)为0.855(95%CI=0.794-0.904,敏感性=89.8%和特异性=73.9%)。随后在验证集中检测其表达趋势及诊断效能,AUC为0.826(95%CI=0.745-0.890,敏感度=89.7%,特异度=69.0%)。最后我们构建出circRNA-miRNAs-mRNAs互作网络图,并验证得出结直肠癌患者血清外泌体hsa-miR-6833-3P、hsa-let-7i-3p and hsa-miR-1301-3P 的表达水平与 circ-PNN 呈负相关。结论:本研究通过分析、验证血清外泌体的circRNAs高通量测序结果,发现外泌体circ-PNN在结直肠癌中高表达,对结直肠癌的诊断具有良好的敏感性和特异性,可以较好地区分结直肠癌患者和健康对照者,因此可作为结直肠癌诊断的潜在生物标志物。