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先天性全身脂肪营养不良Ⅱ型(congenital generalized lipodystrophy type 2, CGL2)的临床特征是全身脂肪组织减少、脂糖代谢异常、精神发育迟滞(mental retardation)。精神发育迟滞主要是指抑郁或焦虑等情感的障碍、认知功能的低下。11号染色体长臂的seipin基因无义突变(seipin缺失)被认为是CGL2的主要病理机制。seipin蛋白主要表达在脂肪细胞、神经细胞和睾丸细胞。有研究证明,脂肪细胞的seipin缺失通过抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARy)的表达和活性,能阻碍脂肪细胞的分化,导致脂肪细胞缺失。睾丸细胞seipin缺失可引起精子形态畸形。原位杂交检测结果显示seipin在中枢神经系统的大脑皮层、海马、下丘脑、脑干和小脑等脑区选择性高表达。但是有关seipin缺失对情感和认知行为的影响迄今未见报道。抑郁症患者脑内PPARγ水平明显低于正常人群。临床研究已报道,PPARγ激动剂能有效地改善抑郁症患者的症状。阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)患者脑内的PPARy水平也低于非认知障碍人群,PPARy激动剂能改善AD病人的认知功能。PPARy下调能抑制ERK1/2-cAMP反应元件结合蛋白(CREB)信号通路的活性。海马突触传递的NMDA受体依赖型长时程增强(LTP)被认为是认知记忆的细胞模型,LTP的诱导依赖于胞内钙调蛋白启动ERK1/2-CREB信号通路。有研究发现雌激素能正向调节PPARγ的表达。此外,Wei等报道了原代培养神经细胞的seipin敲低能减少谷氨酸受体的表达和NMDA受体在细胞膜的分布。因此,神经系统seipin缺失有可能通过降低脑的PPARγ水平影响情感和认知行为。研究目的1、明确seipin缺失对小鼠情感行为的影响及其性别差异。2、探讨seipin缺失对小鼠空间认知行为的影响及其分子机制。第一部分seipin缺失对小鼠情感行为的影响及其性别差异实验方法1.动物模型的制备和鉴定：全身seipin基因敲除(seipin-sKO)、神经系统seipin基因敲除(seipin-nKO)和脂肪细胞seipin基因敲除(seipin-fKO)小鼠模型由北京大学刘国庆教授提供。提取尾部DNA,用PCR方法鉴定基因型。2.动物行为学检测：(1)开场实验(OFT)：记录运动的总路程、直立次数,分析自发活动情况；在中央区域的时间反映焦虑样行为。(2)高架十字迷宫实验(EPM)：记录在开臂的时间,分析焦虑样行为。(3)强迫游泳实验(FST)：记录保持不动的累积时间,分析抑郁样行为。(4)悬尾实验(TST)：记录保持不动的累积时间,分析抑郁样行为。(5)游泳实验：记录游泳的时间,以游泳速度(距离／时间)分析运动功能。(6)转轮实验：记录不同转速下的掉落潜伏期,分析运动协调功能。3.激素水平检测：放射免疫法检测血清雌激素、睾酮水平；ELISA检测血清皮质酮水平。4.实时定量逆转转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹法(Western blot):检测海马和皮层PPARy mRNA和蛋白水平。实验结果1.与野生型(WT)小鼠相比,seipin-sKO雄／雌鼠显示全身脂肪严重缺失,在OFT中央区域时间和在EPM开臂时间显著减少,在FST和TST的不动时间明显延长；在游泳实验中的游泳速度、转轮实验中的掉落潜伏期没有明显改变——seipin映失诱发焦虑-抑郁样行为,但不影响运动功能。2.与对照组雄鼠相比,seipin-nKO雄鼠没有脂肪组织的减少,但是显示OFT中央区域时间和EPM开臂时间显著减少,以及FST和TST的不动时间明显延长。同样与对照组雌鼠相比,seipin-nKO雌鼠也没有脂肪组织减少,在OFT中央区域时间、EPM开臂时间、FST和TST的不动时间均没有明显差异——神经系统seipin缺失诱发性别相关的焦虑-抑郁样行为。3.与对照组小鼠相比,seipin-fKO雄／雌鼠显示全身脂肪组织萎缩,但是在OFT中央区域时间、EPM开臂时间、FST和TST的不动时间均没有明显差异——脂肪组织seipin缺失导致脂肪组织减少不影响情感行为。4.同对照组相比,seipin-nKO雄／雌鼠的雌激素、雄激素和皮质酮水平均没有明显的改变。同WT雌鼠相比,seipin-sKO雌鼠的雌激素水平降低。5.雌激素处理能改善seipin-nKO雄鼠的焦虑-抑郁行为。seipin-nKO雌鼠的卵巢摘除能引起在EPM开臂停留时间减少,FST和TST的不动时间延长——雌激素能改善seipin缺失所致的情感障碍。6.与对照组相比,seipin-nKO雄鼠海马皮层PPARγ mRNA和蛋白水平明显减少,但是seipin-nKO雌鼠的PPARγ表达没有改变——seipir缺失能性别选择性地减少神经系统PPARγ表达。雌激素能增加seipin-nKO雄鼠PPARγ表达,卵巢摘除导致seipin-nKO雌鼠的PPARγ减少——雌激素能缓解seipin缺失所致的PPARγ低表达。7. PPARy激动剂罗格列酮14天处理能改善seipin-nKO雄鼠焦虑-抑郁样行为。结论(1)神经系统seipin缺失通过抑制PPARγ表达诱发焦虑-抑郁样行为。(2)雌激素能增加PPARγ表达,通过改善seipin缺失所致的PPARy水平降低,能缓解seipin-nKO小鼠的焦虑-抑郁样行为。第二部分seipin缺失对认知行为的影响及其分子机制实验方法1.动物模型的制备和鉴定:同第一部分。2.认知行为的检测:采用Morris水迷宫,记录明台实验的游泳速度,检测运动协调性和视觉灵敏性;记录暗台实验的登台潜伏期、撤台实验的目标象限停留时间,分析空间学习记忆能力。3.场电位记录:制备海马冠状切片,检测海马Schaffer侧支-CA1突触的兴奋性突触后电位(EPSP)、双脉冲易化(PPF)以及高频刺激(HFS,100Hz-100pulses)或θ条件刺激(100Hz-10 pulses)对长时程增强(LTP)的诱导。4.全细胞膜片钳记录:制备海马冠状切片,检测脑片海马CA1锥体神经元NMDA受体介导的电流(NMDA-indcued current,INMDA)和AMPA受体介导的电流(AMPA-indcued current,IAMPA)。5.酶联免疫吸附分析法(ELISA):检测海马BDNF的水平。6.RT-PCR:检测谷氨酸AMPA受体和NMDA受体亚基m RNA水平。7.Western blotting:检测AMPA受体和NMDA受体亚基的表达,以及ERK1/2和CREB的磷酸化水平。实验结果1.与WT雄鼠相比,seipin-s KO雄鼠在水迷宫实验中登台潜伏期明显延长、撤台后在目标象限时间减少。与对照雄鼠相比,seipin-n KO雄鼠也表现登台潜伏期明显延长和目标象限时间减少,但是seipin-f KO小鼠没有显示登台潜伏期和目标象限游泳时间的改变——神经系统seipin缺失导致认知功能障碍。2.与对照组相比,seipin-n KO雄鼠海马Schaffer侧支-CA1突触的EPSP斜率明显降低,不伴有PPF的比值改变——seipin缺失诱导突触传递功能降低,但不影响突触前神经递质的释放。3.在对照组雄鼠,高频刺激或θ条件刺激海马Schaffer侧支能引起CA1区EPSP斜率的长时程增加,即LTP的产生。但是,在seipin-n KO雄鼠同样的条件刺激不能诱导LTP——seipin缺失损害LTP诱导。4.同对照组相比,seipin-n KO雄鼠海马CA1锥体神经元NMDA诱导的电流(INMDA)没有差异,但是谷氨酸AMPA诱导的电流(IAMPA)幅值显著减小。seipin-n KO雄鼠海马AMPA受体亚基Glu R1和Glu R2 m RNA和蛋白水平明显低于对照组,但是NMDA受体亚基(NR1、NR2A和NR2B)表达没有改变——seipin缺失选择性抑制AMPA受体表达。5.与对照组相比,seipin-n KO雄鼠海马BDNF水平没有改变;ERK和CREB磷酸化水平明显降低——seipin缺失抑制ERK-CREB信号活性。6.seipin-n KO雄鼠给予PPARγ激动剂罗格列酮3天处理能显著提高ERK和CREB磷酸化水平,增加AMPA受体表达和IAMPA幅值。MEK抑制剂U0126可以阻断罗格列酮增加CREB的磷酸化——seipin缺失通过减少PPARγ水平抑制AMPA受体表达和功能。7.seipin-n KO小鼠给予PPARγ激动剂罗格列酮能恢复突触传递功能及LTP诱导,改善seipin-n KO小鼠的认知障碍。U0126可以阻断罗格列酮恢复AMPA受体的表达和功能,以及LTP诱导——seipin缺失通过抑制AMPA受体表达导致认知障碍。结论seipin缺失引起PPARγ的表达下降能抑制ERK-CREB信号活性,从而减少谷氨酸AMPA受体的表达,阻碍LTP诱导,最终导致认知障碍。临床意义本研究的结果提示CGL2患者的精神发育迟滞可能与神经系统的PPARγ水平降低有关,因此PPARγ激动剂的使用有可能会改善CGL2患者的认知和情感障碍。