食品用酶本质是一种蛋白质,它的结构十分精巧且复杂。目前针对食品工业酶的研究大多处在应用层面,而理论层面的研究基础还相对薄弱,尤其对食品酶分子层面的研究还在起步阶段。针对这一问题,本课题从理论角度出发,对纤维二糖差向异构酶的结构与功能展开了研究。同时着眼于该酶在乳制品工业中的应用,利用分子生物学与基因工程技术对纤维二糖差向异构酶进行新酶挖掘、分子改造与食品级安全工程菌株构建。纤维二糖差向异构酶是一种新兴的乳制品工业用酶,该酶不需要辅酶与共底物的加入,可独立催化低价值的乳糖进行两种生物转化反应,用于乳果糖和依匹乳糖的生产。乳果糖和依匹乳糖是两种功能性甜味剂,具有多种有益健康的生物活性。但目前所知的纤维二糖差向异构酶还存在酶活较低、温度稳定性不足等问题,难以满足不同工作环境下的高效工业化生产的需求。计算机技术和计算资源的高速发展为酶的理论研究提供了新的思路,人们在计算机辅助下可对酶分子的结构稳定性和催化机理进行分子层面的理论研究。本课题通过计算机辅助手段,对已知的纤维二糖差向异构酶进行了分子改造。半理性设计了稳定性提高的突变体库。通过对突变体库进行酶活检测,找到了一株温度稳定性和异构化酶活均提高了的纤维二糖差向异构酶突变体CsCE-M5/E327D。相同反应体系下,该酶突变体1 h所产乳果糖量高于野生型4 h所产乳果糖量。本课题使用分子动力学模拟手段对纤维二糖差向异构酶的结构灵活性进行了分析。结果表明计算机模拟得到的计算数据（结构均方根偏差、氢键数量）与酶分子的热稳定性实验数据有一定的相关性,相比于静态分析能够更准确的预测蛋白质结构的稳定性与灵活性。通过对有底物的纤维二糖差向异构酶进行分子动力学模拟,对该酶的催化机理进行了探讨。推测了该酶底物的开环过程中新的关键残基,并通过突变实验进行了验证。还确定了纤维二糖差向异构酶催化异构化过程的限速步骤,为该酶未来的理性设计打下了基础。通过分子动力学模拟在数据库中定向搜索到了在低温环境下仍然具有一定灵活性的野生型酶基因。将来源于Roseburia intestinalis的纤维二糖差向异构酶基因在大肠杆菌表达系统中进行异源表达,并通过镍亲和层析法进行分离纯化,随后对纯酶进行了酶学性质鉴定。纯酶的相对分子质量约为43.5 kDa,最适pH为7.0,最适温度为45°C;该酶对乳糖的差向异构化K_m值为429.9±57.3 mM,k_cat值为117.0±7.7 s^-1,k_cat/K_m值为0.27 mM^-1 s^-1,以纤维二糖为底物时差向异构化反应的动力学参数值分别为131.0±11.6mM、98.5±2.9 s^-1和0.75 mM^-1 s^-1。在8°C低温条件下,该酶的差向异构化酶活是目前所报道活性最高的野生型纤维二糖差向异构酶的18.5倍。十分适合工业低温条件下对乳糖的转化。结果表明分子动力学模拟方法可以使野生酶的挖掘过程更高效、合理。本课题构建了整合型质粒将纤维二糖差向异构酶基因与抗生素抗性基因一同插入到枯草芽孢杆菌染色体上,筛选到整合工程菌后再通过Cre/lox特异性重组系统敲除抗性基因,得到整合型安全表达的工程菌,该整合型重组菌的最高发酵酶活为0.325 U/mL;又构建了含有D-丙氨酸消旋酶基因但不含抗生素抗性的双启动子可复制质粒,转化到D-丙氨酸缺陷型枯草芽孢杆菌宿主中,得到了质粒型安全表达工程菌,该工程菌的最高发酵酶活大于7 U/mL;使用乙醇处理的方法将枯草芽孢杆菌菌体的产依匹乳糖能力提高了3.67倍,通过将产物中乳糖降解、酵母发酵、离子交换层析的方式构建了一条不含致病菌和抗生素的产依匹乳糖食品安全级生产流程。将依匹乳糖的纯度提高到98%以上,产率为24%。