8-异前列腺素F2α和p22phox C242T基因多态生与2型糖尿病肾病患者的相关性研究

来源 :河北医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:sky007
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目的:糖尿病肾病(Diabeticnephropathy,DN)是糖尿病的主要慢性微血管并发症之一,也是导致终末期肾功能衰竭的重要原因,肾小球基底膜增厚和细胞外基质的积聚是DN的主要病理学特征。Ceriello等提出氧化应激(Oxidativestress,OS)是参与糖尿病及其并发症的关键环节[1],而NADPH氧化酶是机体产生氧自由基(Reactiveoxygenspecies,ROS)的关键酶,其中亚基p22phox对NADPH氧化酶产生ROS发挥关键作用,并且p22phox基因第242位的C突变为T可导致NADPH氧化酶活性的改变[2]。8-异前列腺素F2α(8-iso-prostaglandinF2α,8-iso-PGF2α)是近年来新发现的异前列腺素类代谢产物,被认为是评价机体氧化应激的理想指标[3-5]。因此本研究采用酶联免疫吸附(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)法检测8-iso-PGF2α从而明确氧化应激在DN中的作用;通过检测DN患者NADPH氧化酶p22phox亚基242位点的基因分布,探讨该基因多态性与DN的关系。  方法:试验组为选取本院内分泌科住院的2型糖尿病(Type2diabetesmellitus,T2DM)患者206例,其中男125例,女81例,年龄为(55.45±11.69)岁,均符合1999年WHO糖尿病诊断和分型标准,为河北地区汉族人,彼此间无亲缘关系。入选者均排除其它内分泌疾病、恶性肿瘤、泌尿系感染、其他原因引起的肾脏疾病,无冠心病、心功能不全、炎症和慢性肝脏疾病,亦无糖尿病急性并发症。根据尿微量白蛋白与肌酐比值(男>2.5mg/mmol,女>3.5mg/mmol)将患者分为两组:①单纯糖尿病(Simplediabetes,SDM)组102例,男61例,女41例,年龄(54.22±10.42)岁;②DN组104例,男64例,女40例,年龄(56.65±12.76)岁。  正常对照(Normalcontrol,NC)组为同期我院医务人员及常规体检者100例,其中男63例,女37例,年龄(52.8±11.4)岁,河北汉族人,无亲缘关系,均无糖尿病、高血压、心脑肾等疾病史。正常对照组和试验组性别与年龄匹配。  (1)临床资料收集:包括性别、年龄、糖尿病病程、身高、体重等,计算体质量指数(Bodymassindex,BMI);测量并记录血压。  (2)血生化指标检查:入试者均隔夜空腹8-12小时后于次日晨起抽取静脉血,使用全自动生化仪测定空腹血糖(Fastingplasmaglucose,FBG)、总胆固醇(Totalcholesterol,TC)、甘油三酯(Triglycerides,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(High-densitylipoproteincholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(Low-densitylipoproteincholesterol,LDL-C);  (3)放射免疫法γ计算器检测空腹胰岛素(Fastinginsulin,FINS)并计算胰岛素抵抗指数[HOME-IR=FINS(mU/L)×FPG(mmol/L)/22.5];  (4)免疫比浊法测定糖化血红蛋白(HbA1c)与尿微量白蛋白比肌酐(尿A/Cr);  (5)酶联免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELASA)测定血清中8-iso-PGF2α水平。  (6)基因多态性的测定:①提取DNA:2%乙二胺乙酸(EDTA)抗凝血3ml,血液基因组DNA小量提取试剂盒提取白细胞DNA,紫光分光光度仪测定DNA浓度及纯度。②聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(Polymerasechainreaction-Restrictionfragmentlengthpolymorphism,PCR-RFLP)法检测p22phox基因型:以外周血白细胞DNA为模板进行PCR扩增,上下游引物序列分别为:5-GTGAGTCTCCTCCTGCTCTGG-GGT-3、5-GCTTGTTTCGGTCCTGGGTGTTCT-3,反应体系25ul,其中含12.5ulPCRPremix,8.5ul灭菌双蒸馏水,上下游引物各1ul,模板DNA2ul。在PCR循环仪中94℃预变性5分钟;并按下列程序循环35次,即94℃预变性30秒,50℃退火30秒,72℃延伸1分钟;末次循环后,72℃延伸7分钟,然后用限制性内切酶RsaⅠ进行酶解消化,最后对其产物进行琼脂糖凝胶电泳,根据电泳条带类型判断p22phox基因型。CC基因型:348bp;CT型:160bp、188bp、348bp;TT型:160bp、188bp。  统计学处理:应用SPSS20.0统计软件对结果进行统计学处理,计量资料以均值±标准差(s)表示,并检验正态性;组间比较用方差分析;计数资料组间比较用卡方检验;按Hardy-Weinberg平衡法检验样本的群体代表性;Spearman相关分析法分析8-iso-PGF2α浓度与其他因素的相关性;Logistic回归分析法分析T2DM的危险因素。  结果:①试验组与正常对照(NC)组性别、年龄构成比无明显差异,有可比性;试验组的SBP、DBP、BMI、FBG、TC、TG、LDL-C、HbA1c均显著高于NC组(P<0.05),HDL-C显著低于NC组(P<0.05);其中糖尿病肾病(DN)组的BMI、FBG、TC、LDL-C、IR均显著高于单纯糖尿病(SDM)组(P<0.05),HDL-C则显著降低(P<0.05);②试验组血清8-iso-PGF2α水平(41.66±21.64pg/ml)明显高于NC组(27.95±12.69pg/ml)(P<0.05);DN组8-iso-PGF2α水平(50.13±24.86pg/ml)明显高于SDM组(33.03±13.10pg/ml)和NC组(27.95±12.69pg/ml)(P<0.05)。③血清8-iso-PGF2α与SBP、DBP、BMI、FBP、TC、TG、LDL-C、HbA1c呈显著正相关(P<0.05或P<0.01)与HDL-C呈显著负相关(P<0.05)。④DN组CT+TT基因型频率明显高于SDM和NC组(23.1%比13.7%、9%,P=0.039);DN组T等位基因频率亦明显高于SDM和NC组(12.5%比6.9%、4.5%,P=0.009)。⑤CT+TT基因型组的HbA1c、IR及8-isoPGF2α均较CC基因型组升高(P<0.05或P<0.01)。CT+TT组DN发病率为53.8%,亦高于CC组31.1%(P<0.05)。⑥Logistic回归分析示:BMI、TG、8-isoPGF2α及IR为DN的独立危险因素。  结论:  1、T2DM患者体内存在氧化应激,氧化应激可能参与了糖尿病肾病的发生。  2、血清中8-iso-PGF2α水平与p22phox基因多态性密切相关,携带T等位基因者血清8-iso-PGF2α水平较高。  3、8-iso-PGF2α是DN的独立危险因素,但T等位基因不是DN的独立危险因素。
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