纳米抗体是由骆驼科或软骨鱼体内仅由重链组成的特殊抗体的可变区克隆得到的最小的蛋白质功能域,应用前景十分宽广。本课题首先探究了骆驼源样本RNA的提取方法,并对其提取条件进行了优化;利用优化后的方法获取了 20峰双峰驼外周血淋巴细胞和1峰双峰驼脾脏细胞RNA,经cDNA反转、扩增、连接噬菌体,电转化等步骤构建了 4个驼源天然纳米抗体库,采用固体菌落计数法和高通量测序技术对四个文库的库容量和多样性进行了鉴定。结果如下。1.RNA提取优化实验的结果显示,两种提取方法得到的RNA的A260/A280值和A260/A230值的数据均处于正常值区间;RNA的得率方面,沉淀法优于硅基膜法,是其2倍以上;RT-PCR检测发现硅基膜法提取的RNA可见目的条带。2.噬菌体展示文库实验结果显示,成功构建了 CNL1、CNL2、CNL3和CNL4四个抗体文库,且库容量均较好,分别为4.21× 109、4.10×109、1.74×109和4.10×109。经随机克隆抽样验证插入率,表明四个抗体库的插入率均为100%。3.高通量测序数据显示唯一序列与非唯一序列的比例分别为87.70%、89.22%、89.84%和86.45%,绝大部分氨基酸序列的特征位点发生亲水性突变,符合VHH抗体的稳定结构,构建的抗体文库中大部分氨基酸序列含有4个半胱氨酸,少量序列多至8～10个,这有利于抗体结构多样性的形成。CD-HIT以相似度水平80%聚类后,聚类数具有较大值,Clustal工具分析发现保守位点的长度和分布差异性大,MEGA软件绘制进化树序列距离较远。综上可知,相较于沉淀法,硅基膜法更适于骆驼源RNA的提取。采用硅基膜法提取建库用RNA结合噬菌体展示技术成功构建出4个天然纳米抗体库。高通量测序技术鉴定出构建的天然纳米抗体库多样性良好,具有较大的应用潜力。