雄激素受体介导的miR-7在前列腺癌去势治疗中发挥的作用及其机制研究

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前列腺癌(PCa)目前已成为发达国家男性中最常见的肿瘤,并且其致死率位居第二,而大部分致死原因为远处转移。在中国,前列腺癌的发病率近年来也呈上升趋势。从20世纪40年代起,对于无法进行手术的前列腺癌的标准化治疗即为雄激素剥夺治疗(ADT),其通过抑制雄激素的产生或者阻断雄激素与雄激素受体(AR)结合从而使AR表达下降从而达到治疗的目的,然而,大部分病人在18到24个月后就出现治疗耐受,即使血清睾酮达到去势水平,病人的PSA水平仍持续升高,发展成为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。其主要原因在于AR在被抑制的过程中的质和量发生了变化,然而具体机制尚不明确,引发人们众多探索。近年来,非编码RNA(non- coding RNAs),特别是微小RNA(miR)调控基因表达研究的兴起为该问题的解决提供了新的视角,miR是真核生物中广泛存在的长约22-25个核苷酸的非编码RNA分子,通过与靶mRNA特异结合抑制转录后基因表达,在调控细胞周期、生物体发育时序等方面起重要作用。在动物体中,个miR通常可以调控数十个基因。miR自身的表达也受到转录因子的调控,而AR本身也是一种转录因子,因此,了解在发展成为CRPC的过程中,AR对miR的调节情况及其下游的变化有助于人们更加全面的了解AR在前列腺癌发展成为CRPC过程中的作用。工作目的:初步探索雄激素受体介导的miR-7在前列腺癌去势抵抗中发挥的作用,并选择表皮生长因子受体(EGFR)作为miR-7的下游研究对象,探索miR-7的作用机制。研究方法:(1)通过查阅PROmiRNA数据库,筛选并确定AR作为转录因子是否调节miR-7的表达。(2)收取24例前列腺癌根治性切除组织标本,其中术后免疫组化AR(-)13例,AR(+)11例,用RNAprep pure福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPE)切片总RNA提取试剂盒提取石蜡组织的总RNA,再运用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)技术对AR(-)组和AR(+)组分别进行所选定miR的监测,比较两组间miR的表达,并且分别比较每组内癌组织与正常组织间miR的表达差异。(3)选用不含AR表达的前列腺癌细胞系DU145,对细胞系以Lipo2000瞬时转染miR-7抑制物(miR-inhibitor)并孵育48-72小时后,使用蛋白质免疫印迹(WB)检测EGFR的表达情况。 (4)用相同的方法转染miR相似物(miR-mimic),以qRT-PCR和WB观察EGFR下游蛋白Raf的表达情况,对AR介导的EGFR的下游进行初步探索。研究结果:(1)查阅PROmiRNA数据库发现,发现miR-7前体miR-7-1的启动子区具有AR的作用位点。(2)石蜡标本中,AR(+)组中,前列腺癌的miR-7表达和正常组织没有差异(p=0.118),而在AR(-)组中,前列腺癌的miR-7表达明显低于正常组织(p=0.002);同时取两组的正常组织进行比较,AR(+)组和AR(-)组的miR-7表达没有明显差异(p=0.278),而将miR-7进行肿瘤/正常组织时,AR(+)组中miR-7的表达则明显高于AR(-)组(p=0.001)。(3)在DU145细胞系实验中,转染miR-7 inhibitor后,WB结果显示EGFR的表达明显上升。(4)在DU145细胞系转染miR-7 mimic后,qRT-PCR和WB的结果均显示raf的rnRNA口蛋白的表达量有明显下降。结论:在前列腺癌的去势治疗中,AR的下调可使miR-7的表达明显下降,而miR-7在前列腺癌中对EGFR的表达起着抑制作用,并且通过raf影响着前列腺癌细胞的生物学行为。
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