【摘 要】
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草甘膦（N-phosphonomethyl-glycine，glyphosate）是一种广谱灭生性、内吸传导型的除草剂，对人畜低毒，低残留，有很高的商业价值，在全世界范围内得到了广泛使用。草甘膦N-乙酰转移酶（glyphosate N-acetytransferase，GAT）是一种能够通过转乙酰基的反应将草甘膦代谢为低毒物质——乙酰草甘膦的酶。草甘膦N-乙酰化为作物抗草甘膦提供了不同于EPSPS
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草甘膦（N-phosphonomethyl-glycine，glyphosate）是一种广谱灭生性、内吸传导型的除草剂，对人畜低毒，低残留，有很高的商业价值，在全世界范围内得到了广泛使用。草甘膦N-乙酰转移酶（glyphosate N-acetytransferase，GAT）是一种能够通过转乙酰基的反应将草甘膦代谢为低毒物质——乙酰草甘膦的酶。草甘膦N-乙酰化为作物抗草甘膦提供了不同于EPSPS途径的全新作用机制，它在抗除草剂转基因作物中具有潜在的应用价值。本研究从地衣芽胞杆菌Bacillus．licheniformis（Weigmann）Chester AB 94036中扩增得到草甘膦N-乙酰转移酶基因（gat），将其克隆到高效表达载体pGEX 6p-1上，转化到大肠杆菌DH5α中，获得含有重组质粒pGEX-gatn的重组菌株。为了提高野生型GAT蛋白的活性，本研究通过定点诱变的方法，在野生型GAT蛋白中分别引入了Glu 67 Arg和ILe 132 Arg两个突变位点。对野生型和突变型重组菌株进行IPTG诱导表达，得到了大约43 kD的GAT-GST融合蛋白。然后，经过GST亲和层析纯化，获得凝胶电泳均一的约17 kD的目的GAT蛋白。通过酶标仪和连续分光光度分析法，对野生型和突变型GAT蛋白进行了酶反应动力学测定。通过比较GATGlu 67 Arg和GATIle 132 Arg蛋白与GATn的催化常数Kcat值和米氏常数KM值，发现对于Kcat值：GATn＜GAT(Ile 132 Arg＜GATGlu 67 Arg；而对于KM值则是GATGlu67 Arg＜GATn＜GATIle 132 Arg。GATGlu 67 Arg和GATIle 132 Arg的催化效率Kcat/KM分别比GATn蛋白高4倍和3倍。以上数据表明，GAT酶的67和132这两个位点对酶的转乙酰基的活性有一定的贡献作用，均引起了GAT酶活的提高。这一结果为GAT酶的进一步的体外改良研究奠定了基础。
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