我国南方红壤地区土壤质量退化问题严峻,严重限制了该地区农业与环境可持续发展。评价土壤质量的指标主要包括三个方面,物理学指标、化学指标及生物学指标。土壤微生物作为土壤质量的敏感指标,对于土壤质量的早期的微小的变化具有十分重要的作用。长期种植水稻和施肥处理到底对红壤微生物的群落结构产生了何种影响,这方面的研究将为土壤利用方式、施肥类型和施肥方式的选择等提供一些科学依据。由于环境微生物绝大部分种类在实验条件下难以培养,采用分子生物学技术成为微生物多样性研究的趋势,可以绕过微生物分离培养的局限,直接从核酸水平研究自然环境中微生物群落结构。另外,氮素是农业生产中关键的养分元素,是植物生长发育的重要营养物质。在氮素循环过程中土壤微生物对其起着决定性的驱动作用,这些土壤微生物包括固氮微生物、硝化细菌、反硝化细菌等。本课题以长期施肥处理的实验小区(无肥区、无机氮肥区、无机氮肥加秸杆回田区、氮磷钾肥区,分别编号为CK、N、NC、NPK)为背景,采用了限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)分子生物学方法研究不同肥料处理对红壤性水稻土中固氮微生物、硝化细菌、反硝化细菌相关功能基因(nifH、αmoA、nirK、nosZ)多样性的影响。研究结果表明,固氮微生物nifH四个基因文库共得到240个克隆子,75种OTUs,其中丈库nifH-CK的70个阳性克隆中有28个不同的OTUs,丈库nifH-N的58个阳性克隆中有31个不同的OTUs,文库nifH-NC的64个阳性克隆中有27个不同的OTUs,文库nifH-NPK的48个阳性克隆中有22个不同的OTUS。四个文库都具有各自的优势RFLP类型,且文库之间存在一些相同的RFLP类型。不同施肥处理下的土壤固氮微生物的多样性指数有一定差别,即nifH-N>nifH-CK>nifH-NC>nifH-NPK。测序与比对结果显示,大部分OTUs与已知固氮微生物Proteobacteria具有较高的相似性。本研究构建的硝化细菌amoA四个基因文库共有238个克隆子,包括32种OTUs,其中文库amoA-CK的48个阳性克隆中有10个不同的OTUs,文库amoA-N的69个阳性克隆中有11个不同的OTUs,丈库amoA-NC的57个阳性克隆中有16个不同的OTUs,文库amoA-NPK的64个阳性克隆中有14个不同的OTUs。这四个文库都具有各自的优势RFLP类型,且这四个文库的优势RFLP类型基本相同。四个样品的硝化细菌的丰富度指数按照施肥方式排列,amoA-NC>amoA-NPK>amoA-N>amoA-CK。根据测序结果,除一些序列与未培养微生物的同源性较高,大部分序列属于亚硝化螺菌(Nitrosospira)。研究了反硝化细菌nirK、nosZ两个功能基因。对于nirK四个基因丈库共得到298个克隆子,24种OTUs,其中丈库nirk-CK的74个阳性克隆中有14个不同的OTUs,文库nirK-N的74个阳性克隆中有6个不同的OTUs,丈库nirK-NC的75个阳性克隆中有8个不同的OTUs,文库nirK-NPK的75个阳性克隆中有4个不同的OTUs。四个nosZ基因文库共得到284个克隆子,76种OTUs,其中文库nosZ-CK的75个阳性克隆中有19个不同的OTUs,文库nosZ-N的61个阳性克隆中有32个不同的OTUs,文库nosZ-NC的81个阳性克隆中有33个不同的OTUs,丈库nosZ-NPK的67个阳性克隆中有29个不同的OTUs。不同施肥处理条件下土壤反硝化细菌的具有各自的优势RFLP类型,但也存在部分相同的RFLP类型,如nirK基因丈库的四个优势RFLP类型相同。文库多样性指数计算结果表明,四种施肥处理土壤中nirK基因多样性指数差别明显,nirK-CK>nirK-NC>nirK-N>nirK-NPK;而nosZ基因多样性指数从高到低依次为,nosZ-N>nosZ-NC>nosZ-NPK>nosZ-CK。分别挑取了13个nirK克隆子和17个nosZ克隆子进行测序,测序结果表明大部分nirK基因与Proteobacteria的α、β亚簇有较高的同源性；大部分的nosZ基因序列与未培养菌有较高相似性,一些反硝化细菌nosZ基因与a-、 β-、γ-proteobacteria的同源性较高。综合氮素代谢微生物基因多样性研究结果,推测适当施加无机氮肥可能有利于维持红壤性水稻土中的固氮细菌种类,无机氮肥配合施秸秆回田措施可提高红壤硝化细菌的多样性。