鉴于脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的毒性机制和霉菌毒素吸附剂蒙脱石(MMT)的有效性和安全用量尚不完全清楚,本论文拟在验证DON对仔猪生产性能和肠道屏障功能及MMT的保护效果的基础上,以仔猪空肠上皮细胞系IPEC-J2细胞为模型,进一步研究DON对猪肠上皮细胞活性与肠上皮紧密连接蛋白(TJs)的表达与可能信号通路,通过饲养试验评估MMT在仔猪上的安全用量,为防控DON的危害和科学使用MMT提供试验支撑。研究共包括四个试验。试验一 DON对仔猪生产性能和肠道健康的影响及MMT的保护作用本试验按照2×2因子设计,将24头初始体重为7.5 kg的DLY仔猪随机分为4个处理,分别为对照组(C)、蒙脱石组(以0.5%的MMT替换基础日粮中的统糠,MMT)、DON组(在基础日粮中添加2 mg/kg DON,DON)、DON +蒙脱石组(DON组饲粮+0.5%MMT,MMT + DON)。每个处理6个重复,每个重复1头猪,进行28d试验。考察DON对仔猪生产性能、养分表观消化率、血清生化参数、免疫球蛋白、小肠粘膜形态结构和肠道健康相关基因表达的影响及霉菌毒素吸附剂MMT的保护作用。结果表明:1.DON显著降低了仔猪各阶段的平均日增重和平均日采食量(P≤0.05),但对饲料利用率无显著影响(P>0.05)。MMT对仔猪生产性能无显著影响(P>0.05),且DON和MMT无显著交互作用(P>0.05)。2.DON对仔猪的养分表观消化率无显著影响(P>0.05)。MMT显著提高了仔猪对有机物、蛋白质和能量的表观消化率(P≤ 0.05)。DON和MMT无显著交互作用(P>0.05)。3.DON显著降低了仔猪血清碱性磷酸酶(AKP)的活性(P≤ 0.05),提高了血清免疫球蛋白A(IgA)的浓度(P≤0.05)。MMT对血清生化指标和免疫球蛋白无显著影响(P>0.05),且DON和MMT无显著的交互作用(P>0.05)。4.DON显著降低了仔猪空肠绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度(P≤ 0.05),同时引起空肠绒毛断裂、融合、固有层水肿、杯状细胞数量减少。和DON组相比,DON+ MMT组仔猪绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度比显著提高(P≤ 0.05),MMT在一定程度上改善DON引起的空肠粘膜损伤。5.DON显著下调了空肠CLDN3、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、葡萄糖转运载体2(GLUT2),回肠 claudin-4(CLDN4)、zonula occludens-1(Z01)及结肠 claudin-1(CLDN1)mRNA表达(P ≤ 0.05);上调了回肠钠-葡萄糖共转运载体(SGLT-1)的mRNA水平;空肠黏蛋白2(MUC2)和回肠寡肽转运蛋白(PepT-1)的基因表达量有降低的趋势(0.05<P≤0.1)。与DON组相比,0.5%MMT显著下调了回肠SGLT-1 的 mRNA 表达(P≤ 0.05)。本研究结果表明,DON会导致仔猪生产性能下降、部分血清生化指标和免疫球蛋白异常、改变空肠形态并损伤空肠粘膜、影响肠道健康相关基因的表达;MMT可以显著提高仔猪养分的表观消化率,缓解DON引起的仔猪空肠粘膜损伤。试验二DON对猪肠上皮细胞活性及肠上皮屏障完整性的影响本试验以IPEC-J2细胞为模型,考察DON对IPEC-J2细胞活性和肠上皮屏障完整性的影响。试验先采用3×3因子设计,考察分别1000、2000、4000 ng/ml的DON孵育24、48和72h对IPEC-J2细胞活性的影响。结果表明,DON的暴露时间和浓度均显著影响细胞活性(P≤0.05),且两者间有显著的交互作用(P≤0.05)。然后采用3×3因子设计,考察用0、1000、4000 ng/ml的DON孵育IPEC-J2细胞 1、24、48h 对紧密连接蛋白 CLDN1,CLDN3,CLDN4,OCLN 和 ZO1 mRNA相对表达量和蛋白水平的影响。结果表明,DON的暴露时间和浓度对紧密连接蛋白CLDN1、CLDN4、OCLD和ZO1mRNA的相对表达量有显著影响(P≤0.05),且时间和浓度间存在显著的交互效应(P≤ 0.05)。DON的浓度对CLDN3 mRNA表达有显著影响(P≤0.05)。1000ng/ml和4000ng/mlDON处理24h分别显著降低了 CLDN3 和 CLDN1、CLDN3、CLDN4、OCLD 的蛋白水平(P ≤0.05),处理48h后CLDN1、CLDN3、CLDN4和OCLD的蛋白水平均显著降低(P≤0.05)。DON暴露对ZO1的蛋白水平无显著影响(P>0.05)。最后采用3×3因子设计,分别用1000、2000、4000ng/mlDON处理IPEC-J2细胞 1、24 和 48h,通过测定跨上皮电阻(transepithelial electric resistance,TEER)考察DON对肠上皮屏障完整性的影响。结果表明,DON暴露24h和48h后,IPEC-J2细胞的TEER显著降低(P≤0.05)。本研究结果表明DON可能通过影响TJs的表达来破坏肠上皮屏障的完整性。试验三DON影响肠上皮屏障TJs蛋白水平的信号途径本试验以IPEC-J2细胞为研究模型,初探DON影响肠上皮TJs蛋白水平的信号途径。试验先用终浓度为20 μg/ml的蛋白质合成抑制剂放线菌酮(CHX)和4000 ng/ml DON分别处理分化后的IPEC-J2细胞24h。比较CHX和DON分别对紧密连接蛋白CLDN1、CLDN3、CLDN4和OCLN蛋白水平的影响。结果表明:与对照组相比,20 μg/ml CHX 和 4000 ng/ml DON 均显著降低了 IPEC-J2 细胞 CLDN1、CLDN3、CLDN4和OCLD的蛋白水平(P≤0.05),且DON和CHX处理组间无显著差异(P>0.05)。然后用终浓度为20 μmol/1的蛋白激酶C(PKC)抑制剂双吲哚马来酰亚胺盐酸盐(Bis)预处理分化后的IPCE-J2细胞2h,再用终浓度为4000 ng/ml DON继续处理24h。考察Bis和DON联合作用对紧密连接蛋白CLDN1、CLDN3、CLDN4和OCLN蛋白水平的影响。结果表明:与对照组相比,4000 ng/ml DON显著降低了IPEC-J2 细胞 CLDN1、CLDN3、CLDN4 和 OCLD 的蛋白水平(P ≤ 0.05)。与DON组相比,Bis和DON联合作用对OCLD蛋白表达无显著影响,但CLDNs蛋白水平在数值上有所提高,且与对照组无显著差异(P>0.05)。最后用终浓度为10μmol/1的泛素-蛋白酶体抑制剂MG-132预处理分化后的IPCE-J2细胞2h,再用终浓度为4000 ng/ml DON继续处理24h。考察MG-132和DON联合作用对紧密连接蛋白CLDN1、CLDN3、CLDN4和OCLN蛋白水平的影响。结果表明:与对照组相比,4000ng/ml DON显著降低了IPEC-J2细胞CLDN1、CLDN3、CLDN4和OCLD的蛋白水平(P≤0.05);MG-132和DON联合作用后CLDN1和CLDN3的蛋白水平无显著变化(P>0.05),CLDN4蛋白的表达量显著高于DON处理组(P≤ 0.05),但显著低于对照组(P≤ 0.05)。本研究结果表明DON可能通过PKC途径抑制TJs的蛋白质合成和泛素化-蛋白酶体途径促进其降解来影响TJs的蛋白水平。试验四霉菌毒素吸附剂MMT在仔猪上的用量评估将120头28日龄、初始体重为8.0 kg的DLY仔猪随机分为5个处理,分别饲喂在基础日粮中添加0、0.5%、1.0%、2.5%和5.0%MMT饲粮,每个处理6个重复,每个重复4头猪,进行28d试验。考察MMT对仔猪生产性能、血清生化、血清抗氧化能力、组织形态和病理变化及血清和骨骼中矿物元素含量的影响。结果表明:随着MMT添加量的增加,1.仔猪ADG和G:F呈二次曲线变化,ADFI呈线性和二次曲线下降(P≤0.05)。与对照组相比,1.0%MMT组仔猪ADG、ADFI和G:F显著升高(P≤0.05),5.0%MMT 显著降低了仔猪的 ADFI(P≤ 0.05)。2.仔猪肝脏的相对重量呈线性和二次曲线增加,肝脏组织病变程度加深。MMT对仔猪脾脏和肾脏脏器指数及肾脏和空肠形态无显著影响(P>0.05)。3.仔猪血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性呈线性和二次曲线升高(P≤0.05)。4.血清中Cu和Zn的含量呈线性降低(P≤0.05);血清Mg的含量呈线性和二次曲线显著减少(P≤0.05)。与对照组相比,2.5%和5.0%MMT处理组仔猪骨骼中Cu、Mg、Mn、Zn的含量均显著降低(P≤0.05)。饲粮中添加MMT对血清和骨骼中Ca、P、Na、K的含量无显著影响(P>0.05)。5.仔猪血清中T-AOC的浓度呈线性和二次曲线下降,2.5%和5%MMT组T-AOC水平显著低于对照组(P≤0.05);SOD活性呈二次曲线变化,GSH-PX活性呈线性和二次曲线变化,1%MMT组SOD和GSH-PX活性显著高于对照组(P≤0.05);血清中MDA浓度呈线性和二次曲线升高,5%MMT组的MDA浓度显著高于对照组(P≤ 0.05)。本研究结果表明,当MMT的添加量≤1%时,仔猪生产和健康均未受到负面影响;当其添加量≥2.5%时会降低仔猪的生产性能、影响肝脏功能、降低血清和骨骼中矿物元素的含量和血清抗氧化能力。因此,在本试验条件下,MMT的安全添加量不超过1%。综上所述,DON会降低仔猪的生产性能,通过PKC和UPS途径影响肠上皮紧密连接蛋白的表达,破坏肠上皮屏障完整性并损害肠道健康。霉菌毒素吸附剂MMT可以部分缓解DON引起的仔猪空肠粘膜损伤,对仔猪具有一定的保护作用。低剂量的MMT(≤1%)不会影响仔猪的生产和健康。因此,在本试验条件下,MMT的安全添加量不超过1%。